Cuticle Disruption: En metode for å samle hemolymfe fra Drosophila Larver

Abstract

Kilde: Reimels, T. A. og Pfleger, C.M. Metoder for å undersøke lymfekjertel og hemocytter i Drosophila Larver. J. Vis. Utt. (2016).

Drosophila hemolymph fungerer som både blod og interstitiell væske, sirkulerer gjennom hele kroppen under larven og voksenstadiene. Denne videoen beskriver en protokoll for å samle larval hemolymfe for å kvantifisere de sirkulerende cellene.

Protocol

Denne protokollen er et utdrag fra Reimels og Pfleger, Metoder for å undersøke lymfekjertel og hemocytter i Drosophila Larver, J. Vis. Exp. (2016).

1. Sirkulerende hemocyttkonsentrasjon

1. For å oppnå larver av omtrent samme utviklingsstadium for denne analysen, begrens eggsamlingen ved å la kvinner legge egg i en fast tidsperiode på 2 - 6 timer.
2. Samle larver i dissekering av tallerkenbrønner fylt med 1x fosfatbufret saltvann (PBS).
3. For hver larve, plasser 10 μl 1x PBS i et mikrosenterrør på is og 10 μl 1x PBS på en ren dissekeringspute. Plasser dissekeringsputen på en opplyst stereomikroskopbase.
4. Tørk en individuell larve ved å plassere den på en vevsserviett før du overfører den til en PBS-dråpe på disseksjonsputen.
5. Bruk et par tang, riv forsiktig opp og inverter forsiktig kutiklen for å frigjøre hemolymfen.
   MERK: Pass på at du ikke skraper eller jab neglebåndet, da dette potensielt kan frigjøre sessile hemocytter.
6. Bruk en pipet, samle hemolymfen fra dissekeringsputen. Unngå å samle larvrester som den fete kroppen.
7. Tilsett hemolymfen i et mikrocentrifugerør og bland ved å pipettere opp og ned.
   MERK: Flere prøver kan samles på en gang og holdes på is i opptil en time.
8. Valgfritt: Bland Trypan blå med hemolymfprøven i like deler for å farge og utelukke døde celler. Tell celler innen 3 minutter etter å ha lagt til Trypan blå fordi det er giftig for celler.
9. Bland prøven ved å pipettere opp og ned før du laster 10 μl inn i et hemocytometerkammer.
10. Hvis du bruker en automatisert celleteller, angir du passende parametere for cellestørrelse og sirkularitet. Angi for eksempel en minimum cellestørrelse på 2 μm, en maksimal cellestørrelse på 22 μm og en sirkularitet på 75 - 80% rundhet for å oppdage normale, runde hemocytter. Eksperimenter med forskjellige parametere for å oppdage større og spindelformede hemocytter, for eksempel lamellocytter. Alternativt kan du bruke et hemocytometer til å telle hemocytter manuelt.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS tablets	MP Biomedicals	2810305
dissecting dish	Corning	7220-85
microcentrifuge tube	Denville	C2170
silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit	Krayden (distributed through Fisher)	NC9644388 (Fisher catalog number)	Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions.
stereomicroscope	Morrell Instruments (Nikon distributor)	mna42000, mma36300	Nikon models SMZ1000 and SMZ645
tissue wipe	VWR	82003-820
forceps	Electron Microscopy Sciences	72700-DZ
p200 pipette	Eppendorf	3120000054
Countess Automated Cell Counter	Invitrogen	C10227
Countess cell counting chamber slides	Invitrogen	C10283
hemocytometer	Hausser Scientific	3200
trypan blue stain	Life Technologies	T10282