Drosophila Disección tardía del músculo de vuelo indirecto pupa (IFM): un método para la recolección de tejido de alto rendimiento

Overview

Los músculos de vuelo de Drosophila se utilizan como un sistema modelo para el desarrollo muscular y la fisiología. Este video describe la musculatura de vuelo de los adultos y destaca un protocolo para diseccionar el desarrollo de músculos de vuelo indirectos que son adecuados para la secuenciación de ARN de pupas.

Protocol

Este protocolo es un extracto de Kao et al., Dissección de Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches, J. Vis. (2019).

1. Disección ifm después de 48 h APF

1. Monte los equipos necesarios, incluidos dos fórceps de grado de biología #5, tijeras finas, portaobjetos de microscopio de vidrio estándar, cinta adhesiva doble, pipeta, puntas de pipeta, hielo seco y (para aplicaciones de ARN) reactivo de aislamiento (ver Tabla de Materiales). Enfríe los tubos PBS y microcentrífuga 1x sobre hielo.
2. Usando un pincel ligeramente mojado, transfiera la pupa escenificada a una tira de cinta pegajosa de doble cara montada en una diapositiva de microscopio (Figura 1A). Coloque la pupae en una línea, orientada en la misma orientación (ventral hacia abajo y anterior hacia la parte inferior de la diapositiva).
   NOTA: Tenga cuidado de no usar demasiada agua en el pincel o filtro, o las pupas no se pegarán bien. Si las pupas no se pegan, séquelas primero transfiriéndolas a un filtro seco o papel tisular. Montar tantas pupas como se pueden diseccionar dentro de una ventana de tiempo de 30 minutos, idealmente ~ 10 pupas.
3. Retire la pupa de la caja pupal. Utilice fórceps para burlarse y abrir la caja pupal por encima de los espigas anteriores (Figura 1B).
4. Deslice suavemente un par de fórceps dorsalmente hacia la parte posterior, cortando la caja pupal a medida que los fórceps se mueven(Figura 1B'). Tenga cuidado de no romper la pupa subyacente. Libera la pupa de la caja abierta e transfiérala inmediatamente a una caída de 1x PBS en una segunda diapositiva de microscopio(Figura 1B",C).
5. Repita los pasos 1.3 y 1.4 para todas las pupas de la línea, luego reserve la diapositiva de cinta de doble palo.
6. Usando las tijeras finas, corta el abdomen de la pupa lejos del tórax y empújalo en una pila separada(Figura 1D,D'). Repita para las pupas restantes.
   NOTA: Comience a cronometrar la longitud de la disección con el paso 1.6, tan pronto como se interrumpa la integridad pupal. Diseccione tantas moscas como sea posible en 20-30 minutos para prevenir la muerte celular y los cambios transcriptómicos y proteómicos asociados. Al diseccionar 1 d adultos o >90 h pupas, a menudo es conveniente que pasos posteriores retiren adicionalmente la cabeza con las tijeras finas.
7. Usando un papel tisú, retire la mayoría de la 1x PBS (generalmente nublado con grasa suspendida) así como la pila de abdomens(Figura 1E). Agregue una gota de PBS 1x fresco y refrigerado a los tórax restantes.
8. Utilice las tijeras para cortar el tórax por la mitad(Figura 1F, F')cortando desde la cabeza por el eje longitudinal del cuerpo en un solo movimiento. Alternativamente, si se ha quitado la cabeza, primero inserte las tijeras donde estaba unida la cabeza y corte la mitad superior del tórax longitudinalmente entre las IFM. A continuación, corte el lado ventral del tórax con un segundo corte en la misma orientación.
9. Repita los pasos 1.7 y 1.8 para que todas las pupas sean diseccionadas, generando una pila de hemisecciones torácicas cerca del centro del tobogán. Asegúrese de que haya suficiente PBS frío 1x en la diapositiva para que las hemisecciones no se sequen.
   NOTA: Después de 48 h APF, las IFM son lo suficientemente grandes como para ser visibles bajo un microscopio diseccionado estándar al ojo entrenado. En este punto del protocolo, los músculos con una etiqueta fluorescente se pueden mover a un alcance de disección fluorescente para ayudar en la identificación de IFM o con fines de entrenamiento, pero esto no es necesario.
10. Disecciona las IFM del tórax. Aísle una de las hemisecciones utilizando los fórceps #5 (Figura 1G,H). Inserte suavemente las puntas de una fórceps por encima y por debajo del centro de las NIP(Figura 1G',H'). Mientras sostiene los primeros fórceps todavía, utilice tijeras finas para cortar un extremo del IFM lejos de la cutícula y tendones. A continuación, corte el otro extremo del IFM libre de la cutícula(Figura 1G'', H'').
    NOTA: Dependiendo de la orientación del tórax después del primer corte IFM, es útil girar el tórax 180° para que el segundo corte IFM sea más fácil de realizar.
11. Retire el paquete IFM del tórax con fórceps(Figura 1G''',H'''),transfiriéndolo al borde de la burbuja PBS para utilizar la tensión del agua para mantenerlo en su lugar (Figura 1I). Empuje la carcasa hacia el lado opuesto de la diapositiva. Repita las hemisecciones tórax restantes, generando una colección de IFM diseccionados.
    NOTA: Si las IFM no permanecen en una pila ordenada, retire parte del PBS 1x con un tejido. Tenga cuidado de no dejar que todos los PBS se evaporen, y asegúrese de que las IFM diseccionadas y los hemitóraxes permanezcan cubiertos por el buffer.
12. Después de diseccionar todas las IFM, realice rápidamente un control de calidad en el músculo diseccionado. Usando #5 fórceps, retire cualquier músculo de salto o fragmentos de cutícula que puedan haber encontrado su camino en la muestra(Figura 1J-K'').
    NOTA: El músculo de salto parece diferente del IFM. Si se disecciona el músculo etiquetado Mef2-Gal4 bajo fluorescencia, el músculo de salto tiene una fluorescencia más débil y una forma y textura diferentes. Bajo la luz normal, parece casi translúcido, mientras que las IFM son un amarillo opaco y lechoso(Figura 1J-J'',K).
13. Utilizando la tensión del agua, capture (pero no acueste) las NIIF diseccionadas entre un par de fórceps (Figura 1L). Transfiera las NIIF a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml precargado con 250 μL de PBS frío 1x(Figura 1M). Proceda inmediatamente con la sección 2.
    NOTA: Cuando las puntas de fórceps se acercan entre sí y se sacan de una solución de amortiguación, la tensión del agua hace que se capture una burbuja de amortiguador entre las puntas de los fórceps. Si las IFM también están presentes en esta burbuja, se pueden sacar de la solución y transferirse fácilmente a otro receptáculo lleno de búfer. Es importante apretar los fórceps para acercar las puntas entre sí sin tocarse entre sí, para evitar macerar el tejido capturado en la burbuja del amortiguador.

2. Peletizar y preservar la muestra IFM

1. Peletizar las NIIF centrifugando el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml durante 3-5 minutos a 2.000 x g en una centrífuga de mesa (Figura 2A,B).
2. Retire el búfer mediante una punta de pipeta (Figura 2C).
3. Para aplicaciones de ARN, resuspend el pellet IFM en 50-100 μL del búfer de aislamiento de ARN deseado (consulte Tabla de materiales, Figura 2D). De lo contrario, proceda al paso 2.4.
   NOTA: Las NIIF se pueden congelar en seco después del paso 2.2 para preparaciones de espectrometría de masas o aislamiento de ARN con kits comerciales (ver resultados representativos). Para aplicaciones de ARN, se obtienen mejores resultados mediante la resuspendenciación inmediata y la congelación del pellet IFM en búfer de aislamiento.
4. Congelar la muestra sobre hielo seco o congelar en nitrógeno líquido (Figura 2E). Conservar a -80 °C hasta que esté listo para los pasos posteriores en la preparación de la muestra para el análisis posterior.
   NOTA: Después de la criopreservación, las muestras se pueden almacenar durante varios meses antes del procesamiento para la investigación posterior.

Representative Results

Figura 1: Disección de las IFM después de 48 h APF. (A) Alineación de pupas en cinta de doble palo. (B) Eliminación de pupas de la caja pupal abriendo anteriormente, cortando la caja dorsalmente (B'), y levantando la pupa (B ''). Los símbolos circulares representaban lo mismo que la figura 2. (C) Transferencia de pupas al buffer. (D) Extirpación del abdomen cortando con tijeras (flechas dobles amarillas) y separación de los tórax(D'). (E,F) Adición de amortiguador limpio(E),luego corte de tórax por la mitad longitudinal(F,F'). (G,H) Las disecciones se pueden realizar bajo luz blanca (G) o fluorescencia para visualizar el GFP (H); corte de las NIP en un lado (G '),a continuación, el otro lado (G ''); levantamiento del tórax con fórceps (delineado en gris) (G'''). (I,J,K) Colección de IFM en buffer (I) y eliminación del cordón nervioso ventral contaminante (VNC), intestino, y músculo de salto (TDT) (J) para generar una muestra IFM limpia (K). TDT tiene una expresión GFP más baja y una forma diferente a las fibras IFM (J'', K'). (L,M) Uso de fórceps para transferir IFM (L) a un tubo de microcentrífuga (M). Barras de escala = 1 cm (A,E,M), 1 mm (B-D', F-L). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Detalles de conservación ifm y aislamiento de ARN. (A) Las NIIF se peletizan por centrifugación durante 5 min a 2000 x g. (B) Pellet IFM (flecha) y pellet bajo fluorescencia (B'). (C) Eliminación de todo el búfer con una punta de pipeta. (D) Para la extracción de ARN, resuspensión de pellets en búfer de aislamiento. Este paso se puede omitir a las IFM diseccionadas de congelación en seco. (E) Congelación de la muestra en nitrógeno líquido o en hielo seco y almacenamiento a -80 °C. Barras de escala = 10 cm (A), 1 mm (B,B'), 1 cm (C,D,E). (F) Nanogramos (ng) del ARN total del IFM diseccionado obtenido por mosca a 16 h APF, 24 h APF, 30 h APF, 48 h APF, 72 h APF, 90 h APF y 1 d adulto. Barras de error = SD. (G) ARN total aislado de IFM diseccionado de moscas adultas de 50 1 d utilizando diferentes métodos de extracción. Barras de error = SD. (H) Seguimientos representativos para asesinar la integridad del ARN después de diferentes métodos de extracción. Las bandas ribosomales corren justo por debajo de los nucleótidos de 2000 (nt) y la banda de marcadores a 25 nt. Trazas adicionales disponibles en la Figura Suplementaria 1. (I) Rastros representativos de una muestra de ARN recién aislada (parte superior), una muestra congelada 25x sobre hielo seco (segunda parcela), una muestra a la izquierda durante 4 h en el banco (tercera parcela) y una muestra tratada con RNase A (parcela inferior). Observe la degradación completa del ARN al adiciones de RNase A. (J) gel RT-PCR de los kits etiquetados para bru1 y rp49. La intensidad relativa de la banda bru1 normalizada contra rp49 se traza a continuación. Barras de error = SEM (t-test sin apaired, p = 0.0119). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura suplementaria 1. (A,B,C) El ARN produce a partir de muestras del mismo genotipo diseccionadas por el mismo investigador en la misma semana. Después de que todas las muestras fueron diseccionadas, el ARN fue aislado y medido el mismo día. (A) Nanogramos (ng) del ARN total obtenido de disecciones IFM por 1 d mosca adulta. Barras de error = SEM. (B) ARN total obtenido de IFM diseccionado por mosca a 30 h APF, 48 h APF, 72 h APF y 1 d adulto. (C) ARN total aislado de IFM diseccionado de moscas adultas de 50 1 d utilizando diferentes métodos de extracción. (D) Concentraciones totales de ARN por mosca de piernas diseccionadas, músculo de salto (TDT) e IFM. Se obtiene más ARN de las NIIF más grandes. Barras de error = SD. (E) Concentraciones totales de ARN por mosca de IFM diseccionadas de controles en comparación con RNAi o muestras mutantes a 30 h APF, 72 h APF y 1 d adulto. Para mutantes, w¹¹¹⁸ se utilizó como control de wildtype. Los datos mutantes se compilan a partir de bru1-IR, salm^-/- y otro mutante de proteína de unión al ARN. Tenga en cuenta que para estas manipulaciones, los rendimientos de ARN se reducen en 1 d adulto debido a la atrofia muscular y la pérdida, por lo que más moscas necesitan ser diseccionadas para obtener cantidades suficientes para enfoques de omics. Barras de errores = SD. (F) Trazas adicionales que muestran la integridad del ARN para los métodos de aislamiento del ARN que se muestran en la figura 2G y en C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
60 mm culture dishes	Sigma-Aldrich	Z643084-600EA	Greiner dishes, 60 mm x 15 mM, vented
Cell phone camera, Samsung Galaxy S9	Samsung	SM-G960F/DS	used for photos not taken under a microscope
Double stick tape	Scotch/3M	3M ID 70005108587	Double-sided tape, available at most office supply handlers
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20	Inox straight tip 11 cm forceps, Biology grade with 0.05 mm x 0.02 mm tip
fluorescent dissecting microscope camera, Leica DFC310 FX camera	Leica		www.leica-microsystems.com
Fluorescent dissecting microscope software, Leica Application Suite (LAS) version 4.0.0	Leica		www.leica-microsystems.com
Fluorescent dissecting microscope, Leica M165 FC	Leica		www.leica-microsystems.com
Fly: Bru1[M2]			Fly stock; This paper
Fly: Bru1[M3]			Fly stock; This paper
Fly: Mef2-GAL4	Bloomington Stock Center	BDSC:27390	Fly stock
Fly: salm[1]	Bloomington Stock Center	3274	Fly stock
Fly: salm[FRT]			Fly stock; see Spletter et al., Elife, 2018
Fly: UAS-Bru1IR	Vienna Drosophila Research Center	GD41568	Fly stock, RNAi hairpin
Fly: UAS-GFP::Gma	Bloomington Stock Center	BDSC:31776	Fly stock
Fly: UAS-mCD8a::GFP	Bloomington Stock Center	BDSC:5130	Fly stock
Fly: w[1118]	Bloomington Stock Center	3605	Fly stock
Fly: weeP26			Fly stock; see Clyne et al., Genetics, 2003
GFP detection reagent, GFP-Booster	ChromoTek	gba488-100
Glycogen	Invitrogen	10814-010
Image processing software, Photoshop CS6	Adobe		www.adobe.com
Isopropanol	Sigma-Aldrich	I9516-25ML	2-propanol
Method 1 (RNA isolation): TRIzol	Life Technologies	15596018	Guanidinium isothiocyanate and phenol monophasic solution
Method 2 (RNA isolation): Method 1 + TURBO DNA-free Kit	Invitrogen	AM1907	TRIzol isolation followed by treatment with a kit to remove DNA
Method 3 (RNA isolation): Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit	Zymo Research	R2070S	RNA isolation in TRIzol, but over commercial columns instead of using phase separation. Recommended DNase treatment performed with Monarch Dnase I in Monarch DNase I Reaction buffer.
Method 4 (RNA isolation): RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74134	We used the provided DNase treatment. IFM pellets were homogenized in RTL buffer as suggested for animal tissues.
Method 5 (RNA isolation): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System	Promega	Z6110	We applied the protocol for 'Purification of RNA from Fibrous Tissues'.
Method 6 (RNA isolation): Monarch Total RNA Miniprep Kit	New England Biolabs	T2010G	We applied the protocol for tissues/leukocytes and lysed in 300 µL of RNA Protection Reagent.
Microcentrifuge tubes	Thermo Fisher	AM12400	RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL
Microscope slides	Thermo Fisher	12342108	Standard slides, uncharged, 1 mm
Paintbrush	Marabu	1910000000	Marabu Fino Round No. 0, or similar brush from any art supply
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
PBS buffer (1x)	Sigma-Aldrich	P4417	Phosphate buffered saline tablets for 1 L solutions, pH 7.4
PFA PureTip Pipette Tips	Elemental Scientific	ES-7000-0101	Optional substitute for standard pipette tips to reduce sample loss; 100 mL, 0.8 mm orifice
Pipette tips	Sigma-Aldrich	P5161	Universal 200 mL pipette tips
RNA concentration Approach 1 & RNA integrity traces, Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939BA
RNA concentration Approach 2, Nanodrop	Thermo Fisher	ND-2000
RNA concentration Approach 3, Qubit 4 Fluorometer	Invitrogen	Q33238
RNase A	Promega	A7937
RNase-free water, Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758	DEPC treat water overnight and then autoclave, to remove all RNase.
RT Kit #1: Super Script III Reverse Transcriptase Kit	Invitrogen	18080-044	reverse transcription kit
RT Kit #2: LunaScript	New England Biolabs	E3010S	reverse transcription kit
RT Kit #3: QuantiNova Reverse Transcription Kit	Qiagen	205410	reverse transcription kit
Statistical software: GraphPad Prism	GraphPad Prism		www.graphpad.com
Statistical software: Microscoft Excel	Microsoft		Purchased as part of the bundle: Office Home & Student 2019
Table-top centrifuge	Eppendorf	5405000760	Eppendorf Centrifuge 5425 or equivalent
Tissue/ Kimwipes	Sigma-Aldrich	Z188956	Standard tissue wipes
Transfer pipette	Sigma-Aldrich	Z350796	Plastic pipette
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15000-00	3 mm cutting edge, tip diameter 0.05 mm, length 8 cm
Whatman paper	Sigma-Aldrich	1004-070	Filter paper circles, Grade 4, 70 mm