维沃的德罗索菲拉 钙成像：神经元活动功能成像方法

Overview

此视频使用 GCaMP 在德罗索皮拉神经元的体内钙成像中进行描述。特色协议剪辑展示了如何记录在嗅觉调理实验中蘑菇身体神经元的GCaMP荧光变化。

Protocol

本协议摘自汉考克等人， 在Vivo 光学钙成像学习诱导突触可塑性在德罗索菲拉梅拉诺加斯特，J.Vis.Exp.（2019年）。

1. 体内钙成像

1. 使用装有红外激光和水浸目标的多光子显微镜（见 材料表），安装在振动隔离表上。要实现基于 GFP 的钙指示器的可视化，请将激光调至 920 nm 的激发波长，并安装 GFP 带通滤波器。
2. 使用粗Z调整旋钮，扫描大脑的Z轴，并定位大脑感兴趣的区域。使用作物功能仅将扫描重点放在此区域，以最大限度地缩短扫描时间，并旋转扫描视图，使头部前部朝下。
3. 将帧大小调整为 512 x 512 px，扫描速度调整到 > 4 Hz，并扫描区域（在 Y 维度中），以便覆盖感兴趣的神经元。

2. 通过嗅觉调节使气味唤起的钙瞬态可视化

1. 使用气味输送系统，可以以临时精确的方式提供多个气味刺激。
   1. 在实验期间，使用额外的计算机控制设备，并与成像显微镜软件进行通信，以协调气味刺激与图像捕获。
   2. 启动能够连接图像采集软件和气味传递程序的预编程宏包（例如，安装在显微镜控制软件中的 VBA 宏包，参见 材料表），该包响应单独程序中启动气味传递协议提供的外部输入触发器）。
2. 通过监测"训练前"/天真气味唤起的钙瞬态，分辨率为 512 x 512 px，帧速率为 4 Hz 开始测量。 提供 2.5 s 气味刺激，同时为 6.25 s 前气味发作（建立 F₀ 基线值）和气味抵消后 12.5 s 提供额外的图像采集。用第二个气味重复这个，然后用第三个气味。
3. 继续3分钟后，这个测量与经典的调理（"训练"）的苍蝇。
   1. 选择"训练前"阶段呈现的气味之一，成为^CS+ 气味，另一种气味成为^CS- 气味。使用计算机控制的 60 年代气味传递系统以及 12 个 90 V 电击来呈现 CS⁺ 气味。
   2. 休息 60 后， 单独呈现 Cs^- 气味 60s 。用作气味4-甲基环丙醇和3-八氯醇。在本次培训中不要呈现第三种气味（例如，1-octen-3-ol），因为它仅在（第 2.2 步）和（第 2.4 步）训练阶段之前和之后用作控制。
4. 在完成训练阶段（第 2.3 步）后 3 分钟重复"训练前"气味刺激协议（步骤 2.2.）3 分钟，再次测量"训练后"气味唤起的钙瞬态。
   注： 此步骤的时间应反映内存形成后的兴趣时间（例如，在调理步骤后 3-4 分钟执行此步骤以调查短期记忆）。通常，苍蝇可以在这种准备中存活几个小时。
5. 以适当的格式保存成像文件（例如 Tiff），以供以后进行图像分析。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Octen-3-ol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	O5284	Chemical used as odorant
3-Octanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	218405	Chemical used as odorant
4-Methylcyclohexanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	153095	Chemical used as odorant
Bandpass filter for EGFP (525/50 nm)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany
Mineral oil	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	M8410	Used as diluent for odorants
Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2	Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA		Tunable infrared femtosecond laser
Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany		Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices.
Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany	421452-9900-000	Objective W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm
Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger from the odor-delivery device and the electric shock application device (power supply) to interact with the ZEN software from Zeiss that controls the microscope	Custom-written and available upon request	n.a.	n.a.