Drosophila In Vivo Imagerie calcique : une méthode d’imagerie fonctionnelle de l’activité neuronale

Overview

Cette vidéo décrit l’imagerie in vivo de calcium dans les neurones de Drosophila utilisant GCaMP. Le clip de protocole en vedette montre comment enregistrer les changements dans la fluorescence GCaMP des neurones du corps champignon au cours d’une expérience de conditionnement olfactif.

Protocol

Ce protocole est un extrait de Hancock et coll., In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2019).

1. Imagerie in vivo calcium

1. Utilisez un microscope multiphoton équipé d’un laser infrarouge et d’un objectif d’immersion dans l’eau (voir tableau des matériaux),installé sur une table isolée par vibration. Pour la visualisation des indicateurs de calcium à base de GFP, réglez le laser à une longueur d’onde d’excitation de 920 nm et installez un filtre gfp band-pass.
2. À l’aide du bouton d’ajustement Z grossier, scannez l’axe Z du cerveau et localisez la région cérébrale d’intérêt. Utilisez la fonction culture pour concentrer la numérisation uniquement sur cette zone afin de minimiser le temps d’analyse, et de faire pivoter la vue d’analyse de telle sorte que l’antérieur de la tête est orienté vers le bas.
3. Réglez la taille du cadre à 512 x 512 px, la vitesse de balayage à > 4 Hz, et la région de balayage (dans la dimension Y) de sorte que les neurones d’intérêt sont couverts.

2. Visualisation des transitoires de calcium odorants par le conditionnement olfactif

1. Utilisez un système de livraison d’odeurs qui peut fournir plusieurs stimuli d’odeur d’une manière temporellement précise.
   1. Utilisez un ordinateur supplémentaire pour contrôler l’appareil et communiquer avec le logiciel de microscope d’imagerie pour coordonner les stimulations des odeurs avec la capture d’image pendant les expériences.
   2. Lancer un macro package préprogrammé capable de relier le logiciel d’acquisition d’images et le programme de livraison d’odeurs (par exemple, un macro package VBA installé dans le logiciel de contrôle du microscope, voir Tableau des matériaux)qui répond à un déclencheur d’entrée externe fourni par l’initiation d’un protocole de livraison d’odeurs dans un programme distinct).
2. Commencez la mesure en surveillant les transitoires de calcium évoquant l’odeur à une résolution de 512 x 512 px et un taux d’image de 4 Hz. Offrez un stimulus d’odeur de 2,5 s flanqué d’une acquisition d’image supplémentaire pour 6,25 s début d’odeur précédente (pour établir une valeur de référence F₀₎ et 12,5 s après compensation d’odeur. Répétez ceci avec un deuxième odorant, puis avec un troisième odorant.
3. Continuer 3 min après cette mesure avec le conditionnement classique (« formation ») de la mouche.
   1. Sélectionnez l’une des odeurs présentées dans la phase de « pré-formation » pour devenir le CS⁺ odeur et un autre pour devenir le CS^- odeur. Présentez le CS⁺ odeur à l’aide du système de livraison d’odeurs contrôlé par ordinateur pendant 60 s aux côtés de douze décharges électriques de 90 V.
   2. Après une pause de 60 s, présenter le CS^- odeur seul pour 60 s. Utiliser comme odorants 4-méthylcyclohexanol et 3-octanol. Ne présentez pas le troisième odorant (p. ex., 1-octen-3-ol) pendant cette formation car il n’est utilisé comme contrôle qu’avant (étape 2.2.) et après (étape 2.4) la phase d’entraînement.
4. Mesurez à nouveau les transitoires de calcium « post-entraînement » évoqués par l’odeur en répétant le protocole de stimulation des odeurs « pré-entraînement » (étape 2.2.) 3 minutes après avoir terminé la phase d’entraînement (étape 2.3).
   REMARQUE: Le moment de cette étape doit refléter le temps d’intérêt après la formation de la mémoire (par exemple, effectuer cette étape 3-4 min après l’étape de conditionnement pour étudier la mémoire à court terme). En général, les mouches peuvent survivre pendant plusieurs heures dans cette préparation.
5. Enregistrez les fichiers d’imagerie dans un format approprié (p. ex., Tiff) pour une analyse d’image ultérieure.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Octen-3-ol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	O5284	Chemical used as odorant
3-Octanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	218405	Chemical used as odorant
4-Methylcyclohexanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	153095	Chemical used as odorant
Bandpass filter for EGFP (525/50 nm)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany
Mineral oil	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	M8410	Used as diluent for odorants
Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2	Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA		Tunable infrared femtosecond laser
Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany		Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices.
Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany	421452-9900-000	Objective W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm
Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger from the odor-delivery device and the electric shock application device (power supply) to interact with the ZEN software from Zeiss that controls the microscope	Custom-written and available upon request	n.a.	n.a.