Nematode Slide Preparation: Eine Methode, um Tiere auf einem Agar Pad zu mounten

Overview

Während der Live-Bildgebung von C. eleganskann ein Agarose-Pad verwendet werden, um das Nematode still zu halten, ohne es zu beschädigen oder zu trocknen.  In diesem Video wird beschrieben, wie Sie ein einfaches Montagepad für die Mikroskopie vorbereiten.

Protocol

Dieses Protokoll ist aus Teoh et al, Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019) entnommen.

Vorbereitung von Dias für die Bildgebung

1. Bereiten Sie 3-4% w/v Agarose-Lager in einer Mikrowellen-sicheren Flasche (3-4 g in 100 ml Reinstwasser) vor.
   HINWEIS: Agar kann anstelle von Agarose in der gleichen Konzentration verwendet werden.
2. Die Agarose vorsichtig in einer Mikrowelle schmelzen und darauf achten, nicht zu überkochen, bis sich alle Agarose auflöst (klare Lösung). Halten Sie die Lösung bei 70 °C, um eine Erstarrung zu verhindern.
   HINWEIS: Agarose-Bestände können mehrmals verwendet werden. Vor Gebrauch aufwärmen, wenn sich die Agarose verfestigt hat.
3. Mit einer Pasteur-Pipette einen Tropfen geschmolzener Agarose auf ein Mikroskopschlitten legen.
   HINWEIS: Vermeiden Sie Luftblasen im Abwurf des Agars, da diese die Integrität des Pads stören.
4. Drücken Sie sofort das Agarose-Tröpfchen mit einem anderen Mikroskopschlitten nach unten, wobei Sie die Agarose sanft in ein Pad zwischen den beiden Dias abflachen.
   HINWEIS: Alle übrig gebliebenen Blasen sollten in diesem Stadium entfernt werden. Wenn nicht, sollten neue Rutschen gemacht werden, da Tiere leicht in den Blasen stecken bleiben können. Vermeiden Sie einen Überlauf des Agars zur Seite, wenn Sie auf die Rutsche drücken.
5. Lassen Sie die Agarose 1 min trocknen.
6. Trennen Sie die beiden Dias sorgfältig, um Schäden an der Agarose zu vermeiden, während Sie das erstarrte Pad auf einer der Dias lassen.
   HINWEIS: Dias mit Agarose-Pads sollten immer kurz vor dem Experiment frisch zubereitet werden, da sie austrocknen können. Stellen Sie sicher, dass das Agarose-Pad eine gleichbleibende Dicke aufweist. Es sollte keine Luftblasen oder Risse im Pad geben, da dies die Bildgebung stören kann.
7. Fügen Sie einen kleinen Tropfen (5-10 l) von 0,05% Tetramisolehydrochlorid (Anästhetika) in die Mitte des Agarose-Pads.
8. Mit wärmesterilisierter Pickung schnell ca. 10 – 15 Tiere von der Stockplatte auf das Anästhetikum tröpft, bevor die Lösung austrocknet. Vermeiden Sie die Übertragung zu viel OP50-Bakterien, da dies die Lösung trüb macht, was die Bildgebung stören kann.
   HINWEIS: Wenn die Anästhesielösung während der Kommissionierung austrocknet, pipette einfach einen zweiten Tropfen von 0,05% Tetramisolehydrochlorid auf die Tiere. Die Tiere neigen dazu, auf ihrer Seitlichen Seite in der Anästhesielösung zu liegen.
9. Tragen Sie einen Coverslip auf, indem Sie ihn direkt über dem Agarose-Pad positionieren und sanft nach unten fallen lassen. Dies verhindert die Bildung von Blasen. Setzen Sie den Deckel nicht unter Druck, da dies die Tiere zerquetschen kann.
10. Beschriften Sie die Folien mit dem Dehnungsnamen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar-agar	Merck	1.01614.1000
Agarose	Invitrogen	16500-500
Glass coverslips #1	Thermo scientifique	MENCS22221GP
Glass coverslips #1.5	Zeiss	474030-9000-000	Made by SCHOTT
Glass slides	Thermo scientifique	MENS41104A/40
Pasteur pipette	Corning	CLS7095D5X-200EA
Platinum wire	Sigma	267201-2G
Tetramisole hydrochloride	Sigma	L9756-5G