Overview
Questo video descrive una tecnica per schermare rapidamente un singolo nematode per un marcatore genetico mediante screening PCR. Nel protocollo di esempio, mentre ritoriamo l'editing del genoma basato su CRISPR.
Protocol
Il seguente protocollo è un estratto da Prior et al, A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins, J. Vis. Exp. (2018).
PCR a worm singolo e genotipizzazione
- Dopo 1 - 2 giorni di deposizione delle uova, trasferire gli F1s in singoli tappi per tubi a strisce PCR contenenti 7 μL di Worm Lysis Buffer utilizzando un piccone di vermi(Tabella 1, Figura 1D, giorno 4 - 5).
- Centrifuga i tubi PCR alla massima velocità per 1 minuto a temperatura ambiente per portare gli animali sul fondo del tubo e congela i tubi a -80 °C per 1 h.
NOTA: I vermi possono essere conservati a -80 °C indefinitamente. - Lisci vermi congelati in un termociclo utilizzando il seguente programma: 60 °C per 60 min, 95 °C per 15 min, 4 °C di attesa.
- Configurazione della mastermix PCR, come illustrato nella tabella 2.
- Aggiungere 21 μL di mastermix PCR in tubi PCR puliti, quindi aggiungere 4 μL di lisi worm dal passaggio 3. Mescolare bene utilizzando una pipetta ed eseguire il programma PCR seguendo le linee guida dei produttori (vedere Materials Table).
- Purificare le reazioni PCR utilizzando un kit DNA Clean and Concentrate, seguendo le istruzioni del produttore (vedere Materials Table). Elute DNA aggiungendo 10 μL di acqua alla colonna di spin.
- Mastermix enzimatico di restrizione di set-up, come illustrato nella tabella 3.
- Aggiungere 10 μL dell'enzima di restrizione mastermix ad ogni reazione PCR pulita e incubare per 1 - 2 h a 37 °C.
- Separare i prodotti PCR digeriti su un gel di agarosio dell'1,5% eseguito a 120 V utilizzando 1 tampone Tris-acetato-EDTA (TAE).
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Representative Results
Figura 1. Ingegneria CRISPR-Cas9 dellocusC. eleganssod-1. (A) Illustrazione schematica raffigurante la struttura esone-introne del locus sod-1 in C. elegans. La barra rossa indica la posizione del G93 nell'esone 3. L'insieme della coppia di primer è notato dalle frecce rosse (F1-R1). (B) Allineamento della sequenza delle proteine SOD-1 umane e C. elegans (verme). Il residuo mirato del G93 è evidenziato in rosso. (C) Top, una sezione di DNA genomico che circonda il codone G93 è mostrata come riferimento, e i siti di destinazione PAM (verde) e sgRNA (blu) sono evidenziati. Inbasso, viene mostrato il modello HDR (Singolo oligonucleotide) ad oligonucleotide (ssODN) contenente: la modifica del codone che cambia da G93 a A93, una modifica silenziosa al motivo PAM per prevenire la scissione da parte del complesso sgRNA-Cas9, un cambiamento silenzioso per introdurre un sito enzimatico di restrizione HindIII unico (scatola gialla) e i bracci di omologia da 5' e 3' 50 bp (barre nere). Tutte le modifiche nucleotidiche progettate nel ssODN sono evidenziate in rosso. (D) Illustrazione schematica della tubazione per la generazione e l'identificazione di mutanti puntili basati su RNP CRISPR-Cas9. Il giorno 0, iniettare animali da 10 a 15 P0 con miscela di iniezione. Il giorno 2 - 3, identificare gli animali P0 iniettati con successo da quelli contenenti progenie F1 fluorescente e selezionare tre piastre P0 con la progenie più fluorescente. Da ciascuna delle tre piastre P0, singola progenie F1 fluorescente 8. Il giorno 4 - 5, (a) fase 1, i singoli F1 vengonoprelevati e collocati in tubi PCR contenenti Lysis Buffer; b fase 2, dopo il congelamento a -80 °C, i tubi PCR contenenti worm F1 vengono lisci per rilasciare DNA genomico, utilizzato come modello PCR. I prodotti PCR vengono quindi puliti e digeriti con l'enzima di restrizione unico; c fase 3, i prodotti digeriti enzimaticamente sono risolti su un gel di agarosio in cui gli animali di tipo selvatico (+/+), eterozigoti (m/+) e omozigoti (m/m) possono essere identificati mediante modelli di bande di digestione di restrizione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Reagente | [Finale] |
| Kcl | 50 mM |
| Tris-HCl pH 8.3 | 10 mM |
| MgCl2 | 2,5 mM |
| NP-40 | 0.45% |
| Tween-20 | 0.45% |
| Proteinasi K | 1 mg/mL |
La tabella 1. Ricetta tampone worm lysis. La proteinasi K deve essere aggiunta fresca prima di ogni uso.
| Reagente | 1x | 24x |
| Mastermix 2X Q5 | 12,5 μL | 300 μL |
| Primer F1 (10 μM) | 1,25 μL | 30 μL |
| Primer R1 (10 μM) | 1,25 μL | 30 μL |
| Worm Lysis | 4 μL | ---- |
| ddH2O | 6 μL | 144 μL |
| Volume finale | 25 μL | 504 μL |
La tabella 2. Mastermix PCR. Il mastermix PCR deve essere miscelato bene pipettando fino a quando la soluzione non è omogenea. 21 μL del mastermix PCR devono essere aggiunti ai tubi PCR puliti, quindi 4 μL di lisato di verme individuale devono essere aggiunti a tubi etichettati correttamente.
| Reagente | 1x | 24x |
| Tampone enzimatico 10X | 2 μL | 48 μL |
| Reazione PCR pulita | 10 μL | ---- |
| ddH2O | 7 μL | 168 μL |
| Enzima di restrizione (10 U/μL) | 1 μL | 24 μL |
| Volume finale | 20 μL | 240 μL |
La tabella 3. Mastermix enzimatico di restrizione. L'enzima di restrizione mastermix deve essere miscelato bene pipettando fino a quando la soluzione non è omogenea. 10 μL dell'enzima di restrizione mastermix devono essere aggiunti a 10 μL di prodotto PCR pulito.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nuclease-free water | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4004 | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0494L | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| MgCl2 | Sigma | M2393 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| RNaseZap Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 |
