Overview
Denne videoen beskriver en teknikk for raskt å screene en enkelt nematode for en genetisk markør ved PCR-screening. I eksempelprotokollen screener vi for CRISPR-basert genomredigering.
Protocol
Følgende protokoll er et utdrag fra Prior et al, A Rapid and Facile Pipeline forGenerating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins, J. Vis. Exp. (2018).
PcR og genotyping med én orm
- Etter 1 - 2 dager med egglegging, overfør F1s til individuelle PCR-striperørhetter som inneholder 7 μL orm Lysis Buffer ved hjelp av et ormplukk (Tabell 1, Figur 1D, dag 4 - 5).
- Sentrifuge PCR-rør med maksimal hastighet i 1 min ved romtemperatur for å bringe dyr til rørbunnen, og fryse rør ved -80 °C i 1 time.
MERK: Ormer kan lagres ved -80 °C på ubestemt tid. - Lyse frosne ormer i en termocycler ved hjelp av følgende program: 60 °C i 60 min, 95 °C i 15 minutter, 4 °C hold.
- Konfigurer PCR mastermix som vist i tabell 2.
- Tilsett 21 μL PCR mastermix i rene PCR-rør, og tilsett deretter 4 μL ormlys fra trinn 3. Bland godt ved hjelp av en pipette og kjør PCR-program i følge produsentens retningslinjer (se Materialtabell).
- Rens PCR-reaksjoner ved hjelp av et DNA Clean and Concentrate-sett, i henhold til produsentens instruksjoner (se Materialtabell). Elute DNA ved å tilsette 10 μL vann til spinnkolonnen.
- Oppsettsbegrensning Enzym mastermix som vist i tabell 3.
- Tilsett 10 μL av begrensningen enzym mastermix til hver rengjort PCR reaksjon og inkubere i 1 - 2 h ved 37 °C.
- Separate fordøyde PCR-produkter på en 1,5% agarose gel kjøre på 120 V ved hjelp av 1x Tris-acetate-EDTA (TAE) buffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1. CRISPR-Cas9 engineering avC. eleganssod-1 locus. (A) Skjematisk illustrasjon som viser ekson-intronstrukturen til sod-1-locus i C. elegans. Den røde linjen angir plasseringen av G93 i exon 3. Primerparsettet er notert av de røde pilene (F1-R1). (B) Sekvensjustering av humane og C. elegans (orm) SOD-1 proteiner. De målrettede G93-rester er uthevet i rødt. (C) Topp, en del av genomisk DNA rundt G93 codon vises som en referanse, og PAM (grønn) og sgRNA mål (blå) nettsteder er uthevet. Bunn, den enkelt strandede oligonukleotid (ssODN) homology rettet reparasjon (HDR) malen er vist inneholder: codon redigere endre G93 til A93, en stille endring til PAM motivet for å hindre spalting av sgRNA-Cas9 komplekset, en stille endring for å introdusere en unik HindIII begrensning enzym sted (gul boks), og flanking 5 ' og 3 '50 bp homology armer (svarte barer). Alle nukleotidendringer designet i ssODN er uthevet rødt. (D) Skjematisk illustrasjon av datasamlebåndet for generering og identifisering av CRISPR-Cas9 RNP-baserte punktmutanter. På dag 0, injiser 10 - 15 P0 dyr med injeksjonsblanding. På dag 2 - 3, identifiser vellykket injiserte P0 dyr av de som inneholder fluorescerende F1 avkom, og velg tre P0-plater med mest fluorescerende avkom. Fra hver av de tre P0-platene, enkel 8 fluorescerende F1 avkom. På dag 4 - 5, (a) trinn 1 blir individuelle F1s plukket og plassert i PCR-rør som inneholder Lysis Buffer; (b) trinn 2, etter frysing ved -80 °C, lyser PCR-rør som inneholder F1 ormer for å frigjøre genomisk DNA, som brukes som EN PCR-mal. PCR-produktene blir deretter rengjort og fordøyd med det unike begrensningsenzymet; (c) trinn 3, enzymfordøyde produkter løses på en agarosegel der vill type (+/+), heterozygote (m/+) og homozygote (m/m) dyr kan identifiseres ved begrensning av fordøyelsesbåndmønstre. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Reagent | [Endelig] |
| KCl | 50 mM |
| Tris-HCl pH 8.3 | 10 mM |
| MgCl2 | 2,5 mM |
| NP-40 | 0.45% |
| Tween-20 | 0.45% |
| Proteinase K | 1 mg/ml |
Tabell 1. Worm Lysis Buffer Oppskrift. Proteinase K skal tilsettes friskt før hver bruk.
| Reagent | 1x | 24x |
| 2X Q5 Mastermix | 12,5 μL | 300 μL |
| Primer F1 (10 μM) | 1,25 μL | 30 μL |
| Primer R1 (10 μM) | 1,25 μL | 30 μL |
| Orm Lysis | 4 μL | ---- |
| ddH2O | 6 μL | 144 μL |
| Endelig volum | 25 μL | 504 μL |
Tabell 2. PCR Mastermix. PCR mastermix bør blandes godt ved pipettering til løsningen er homogen. 21 μL av PCR mastermix bør legges til rene PCR-rør, og deretter bør 4 μL av individuell ormlysat legges til riktig merkede rør.
| Reagent | 1x | 24x |
| 10X enzymbuffer | 2 μL | 48 μL |
| Rengjort PCR-reaksjon | 10 μL | ---- |
| ddH2O | 7 μL | 168 μL |
| Begrensningsenzym (10 U/μL) | 1 μL | 24 μL |
| Endelig volum | 20 μL | 240 μL |
Tabell 3. Begrensning Enzymet Mastermix. Begrensningen enzym mastermix bør blandes godt ved pipettering til løsningen er homogen. 10 μL av begrensningen enzym mastermix bør legges til 10 μL rengjort PCR produkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nuclease-free water | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4004 | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0494L | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| MgCl2 | Sigma | M2393 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| RNaseZap Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 |
