Single Worm PCR: En metode for å trekke ut og forsterke genomisk DNA

In This Article

Abstract

Kilde: Prior, H., et al. En rask og facile rørledning for generering av genomiske punktmutanter i C. elegans ved hjelp av CRISPR / Cas9 Ribonucleoproteins. J. Vis. Utt. (2018).

Denne videoen beskriver en teknikk for raskt å screene en enkelt nematode for en genetisk markør ved PCR-screening. I eksempelprotokollen screener vi for CRISPR-basert genomredigering.

Protocol

Følgende protokoll er et utdrag fra Prior et al, A Rapid and Facile Pipeline forGenerating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins, J. Vis. Exp. (2018).

PcR og genotyping med én orm

Etter 1 - 2 dager med egglegging, overfør F₁s til individuelle PCR-striperørhetter som inneholder 7 μL orm Lysis Buffer ved hjelp av et ormplukk (Tabell 1, Figur 1D, dag 4 - 5).
Sentrifuge PCR-rør med maksimal hastighet i 1 min ved romtemperatur for å bringe dyr til rørbunnen, og fryse rør ved -80 °C i 1 time.
MERK: Ormer kan lagres ved -80 °C på ubestemt tid.
Lyse frosne ormer i en termocycler ved hjelp av følgende program: 60 °C i 60 min, 95 °C i 15 minutter, 4 °C hold.
Konfigurer PCR mastermix som vist i tabell 2.
Tilsett 21 μL PCR mastermix i rene PCR-rør, og tilsett deretter 4 μL ormlys fra trinn 3. Bland godt ved hjelp av en pipette og kjør PCR-program i følge produsentens retningslinjer (se Materialtabell).
Rens PCR-reaksjoner ved hjelp av et DNA Clean and Concentrate-sett, i henhold til produsentens instruksjoner (se Materialtabell). Elute DNA ved å tilsette 10 μL vann til spinnkolonnen.
Oppsettsbegrensning Enzym mastermix som vist i tabell 3.
Tilsett 10 μL av begrensningen enzym mastermix til hver rengjort PCR reaksjon og inkubere i 1 - 2 h ved 37 °C.
Separate fordøyde PCR-produkter på en 1,5% agarose gel kjøre på 120 V ved hjelp av 1x Tris-acetate-EDTA (TAE) buffer.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

figure-results-1
Figur 1. CRISPR-Cas9 engineering avC. eleganssod-1 locus. (A) Skjematisk illustrasjon som viser ekson-intronstrukturen til sod-1-locus i C. elegans. Den røde linjen angir plasseringen av G93 i exon 3. Primerparsettet er notert av de røde pilene (F1-R1). (B) Sekvensjustering av humane og C. elegans (orm...