Overview
Это видео описывает технику быстрого скрининга одного нематода для генетического маркера путем скрининга ПЦР. В примере протокола мы скрининг для редактирования генома на основе CRISPR.
Protocol
Следующий протокол является выдержка из Prior et al, Быстрый и легкий трубопровод для генерации геномных мутантов точки в C. elegans Использование CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins, J. Vis. Exp. (2018).
Одиночный червь PCR и Genotyping
- После 1 - 2 дней яйцекладки, передача F1s в отдельных ПЦР полосы трубки шапки, содержащие 7 йл червя Lysis Buffer с помощью червя забрать(таблица 1, Рисунок 1D, день 4 - 5).
- Центрифуга ПЦР трубки на максимальной скорости в течение 1 мин при комнатной температуре, чтобы довести животных до дна трубки, и заморозить трубки при -80 градусов по Цельсию в течение 1 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Черви могут храниться при -80 градусов по Цельсию на неопределенный срок. - Lyse замороженных червей в термоциклере, используя следующую программу: 60 градусов по Цельсию в течение 60 мин, 95 градусов по Цельсию в течение 15 мин, 4 кк провести.
- Настройка PCR mastermix, как показано в таблице 2.
- Добавьте 21 МКЛ ПЦР mastermix в чистые трубки ПЦР, а затем добавьте 4 МКЛ червялиза из шага 3. Хорошо смешайте с помощью пипетки и запустите программу PCR в соответствии с руководящими принципами производителей (см. Таблицу материалов).
- Очистите реакции ПЦР с помощью набора DNA Clean and Concentrate, следуя инструкциям производителя (см. таблицу материалов). Elute ДНК, добавив 10 йл воды в спин колонке.
- Настройка ограничения фермента mastermix, как показано в таблице 3.
- Добавьте 10 МКЛ фермента ограничения mastermix к каждой очищенной реакции ПЦР и инкубировать в течение 1 - 2 ч при 37 градусах Цельсия.
- Отдельные переваренные продукты ПЦР на 1,5% агарозного геля работают при 120 V с использованием буфера 1x Tris-acetate-EDTA (TAE).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1. CRISPR-Cas9 инженерныхC. eleganssod-1 локус. (A)Схематическая иллюстрация, изображающая экзон-интронную структуру локуса сода-1 в C. elegans. Красная планка обозначает расположение G93 в exon 3. Набор грунтовой пары отмечен красными стрелками (F1-R1). (B)Последовательность выравнивания белков человека и C. elegans (червь) SOD-1. Целевой остаток G93 выделен красным цветом. (C) Top, раздел геномной ДНК вокруг кодона G93 показан в качестве эталона, и PAM (зеленый) и sgRNA цели (синий) сайты выделены. Внизу, один мель олигонуклеотид (ssODN) гомологии направленного ремонта (HDR) шаблон показан содержащий: кодон редактировать изменение G93 на A93, молчаливое изменение мотива PAM, чтобы предотвратить расщепление sgRNA-Cas9 комплекса, молчаливое изменение ввести уникальный сайт ограничения HindIII (желтый ящик), и фланговые 5' и 3' 50 bp homo. Все нуклеотидные изменения, разработанные в ssODN, выделены красным цветом. (D)Схематическая иллюстрация трубопровода для генерации и идентификации точечных мутантов на основе CRISPR-Cas9 RNP. На 0-й день вводят 10 - 15 Р0 животным с инъекционной смесью. На второй день - 3, определить успешно вводили P0 животных, содержащих флуоресцентные F1 потомство, и выбрать три P0 пластин с наиболее флуоресцентных потомства. Из каждой из трех пластин P0, одиночные 8 флуоресцентных F1 потомство. На 4 - 5 день, а) шаг 1, отдельные F1s собираются и помещаются в ПЦР трубки, содержащие Lysis Buffer; b) шаг 2, после замораживания при -80 градусов по Цельсию, ПЦР-трубки, содержащие червей F1, смыкаются для высвобождения геномной ДНК, которая используется в качестве шаблона ПЦР. Продукты ПЦР затем очищаются и перевариваются с помощью уникального фермента ограничения; c) шаг 3, ферментные усваиваемые продукты решаются на агарозном геле, где дикий тип (яп.), гетерозиготные (м/з) и гомозиготные (м/м) животные могут быть идентифицированы по моделям перепывания пищеварения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| реагент | (Финал) |
| KCl | 50 мМ |
| Трис-HCl рН 8,3 | 10 мМ |
| MgCl2 | 2,5 мм |
| NP-40 | 0.45% |
| Твин-20 | 0.45% |
| Протеиназа K | 1 мг/мл |
Таблица 1. Червь Lysis Буфер Рецепт. Протеиназа K следует добавить свежим перед каждым использованием.
| реагент | 1x | 24x |
| 2X No5 Мастермикс | 12,5 мкл | 300 МКЛ |
| Праймер F1 (10 МКМ) | 1,25 мл | 30 мкл |
| Праймер R1 (10 МКМ) | 1,25 мл | 30 мкл |
| Червь Лисис | 4 йл | ---- |
| ddH2O | 6 йл | 144 йл |
| Окончательный том | 25 мкл | 504 йл |
Таблица 2. ПЦР Мастермикс. PCR mastermix следует хорошо смешивать с помощью труб, пока решение не станет однородным. 21 МКЛ ПЦР mastermix должны быть добавлены для очистки ПЦР труб, а затем 4 МКЛ отдельных лизат червя должны быть добавлены к правильно помечены трубки.
| реагент | 1x | 24x |
| 10X Фермент буфер | 2 МЛ | 48 йл |
| Очищенная реакция ПЦР | 10 йл | ---- |
| ddH2O | 7 мкл | 168 йл |
| Ограничение фермента (10 U/L) | 1 йл | 24 йл |
| Окончательный том | 20 мкл | 240 мкл |
Таблица 3. Ограничение фермента Mastermix. Ограничение фермента mastermix должны быть хорошо смешаны трубопроводов до тех пор, пока решение однородно. 10 МКЛ фермента ограничения mastermix должны быть добавлены к 10 йл очищенного продукта ПЦР.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nuclease-free water | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4004 | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0494L | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| MgCl2 | Sigma | M2393 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| RNaseZap Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 |
