Overview
Bu videoda, PCR taraması ile genetik bir belirteç için tek bir nematodu hızlı bir şekilde tarama tekniği açıklanmaktadır. Örnek protokolde CRISPR tabanlı genom düzenleme için tarama yapıyoruz.
Protocol
Aşağıdaki protokol, CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins , J. Vis. Exp Kullanarak C. eleganlarda Genomik Nokta Mutantları Üretmek için Hızlı ve Facile Boru HattıPrior ve ark.'danbir alıntıdır. (2018).
Tek Solucan PCR ve Genotipleme
- 1 - 2 günlük yumurtlamadan sonra, F1s'yi bir solucan çekme kullanarak 7 μL Solucan Liziz Tamponu içeren tek tek PCR şerit tüp kapaklarına aktarın (Tablo 1, Şekil 1D, gün 4 - 5).
- Hayvanları tüp tabanına getirmek için oda sıcaklığında 1 dakika maksimum hızda Santrifüj PCR tüpleri ve 1 saat boyunca -80 °C'de tüpleri dondurun.
NOT: Solucanlar -80 °C'de süresiz olarak saklanabilir. - Lyse, aşağıdaki programı kullanarak bir termosikleyicide solucanları dondurdu: 60 dakika için 60 °C, 15 dakika için 95 °C, 4 °C tutma.
- Tablo 2'de gösterildiği gibi PCR mastermix'i ayarlayın.
- Temiz PCR tüplerine 21 μL PCR mastermiksi ekleyin ve ardından 3. Pipet kullanarak iyice karıştırın ve üretici yönergelerini izleyerek PCR programını çalıştırın (bkz. Malzeme Tablosu).
- Üretici talimatlarına uyarak DNA Temizleme ve Konsantre kiti kullanarak PCR reaksiyonlarını arındırın (bkz. Malzeme Tablosu). Spin sütununa 10 μL su ekleyerek DNA'yı elute edin.
- Tablo 3'tegösterildiği gibi kurulum kısıtlama enzimi mastermiksi.
- Temizlenen her PCR reaksiyona 10 μL kısıtlama enzimi mastermiksi ekleyin ve 37 °C'de 1 - 2 saat kuluçkaya yatırın.
- Sindirilmiş PCR ürünlerini 1x Tris-asetat-EDTA (TAE) tamponu kullanarak 120 V'te %1,5 agarose jel üzerinde ayırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1. C. eleganssod-1 locus'un CRISPR-Cas9 mühendisliği. (A) C. elegans'taki sod-1 locus'un ekson-intron yapısını gösteren şematik illüstrasyon. Kırmızı çubuk, exon 3'te G93'ün konumunu gösterir. Astar çifti seti kırmızı oklarla (F1-R1) dikkat eder. (B) İnsan ve C. elegans (solucan) SOD-1 proteinlerinin dizi hizalaması. Hedeflenen G93 kalıntısı kırmızı ile vurgulanır. (C) Üst, G93 kodon çevreleyen genomik DNA'nın bir bölümü referans olarak gösterilir ve PAM (yeşil) ve sgRNA hedef (mavi) bölgeleri vurgulanır. Alt, tek iplikli oligonükleotid (ssODN) homology yönlendirilmiş onarım (HDR) şablonu şunları içerir: G93'ü A93'e değiştiren kodon düzenlemesi, sgRNA-Cas9 kompleksi tarafından bölünmeyi önlemek için PAM motifine sessiz bir değişiklik, benzersiz bir HindIII kısıtlama enzim bölgesi (sarı kutu) tanıtmak için sessiz bir değişiklik ve 5' ve 3' 50 bp homoloji kollarını (siyah çubuklar) kuşatmak. ssODN'de tasarlanan tüm nükleotid değişiklikleri kırmızı olarak vurgulanır. (D) CRISPR-Cas9 RNP tabanlı nokta mutantları oluşturmak ve tanımlamak için işlem hattının şematik çizimi. 0. günde, enjeksiyon karışımı ile 10 - 15 P0 hayvan enjekte edin. 2 - 3. günde, floresan F1 soyu içerenler tarafından başarıyla enjekte edilen P0 hayvanlarını tanımlayın ve en floresan soyuna sahip üç P0 plakası seçin. Üç P0 plakasının her birinden, tek 8 floresan F1 soyu. 4 - 5. günde, (a) adım 1, bireysel F1'lertoplanır ve Lizis Tamponu içeren PCR tüplerine yerleştirilir; (b) adım 2, -80 °C'de donduktan sonra, F1 solucanları içeren PCR tüpleri, PCR şablonu olarak kullanılan genomik DNA'yı serbest bırakmak için yutulur. PCR ürünleri daha sonra benzersiz kısıtlama enzimi ile temizlenir ve sindirilir; (c) adım 3, enzim sindirilmiş ürünler vahşi tip (+/+), heterozygous (m/+) ve homozygous (m/m) hayvanların kısıtlanma sindirme bantlama desenleri ile tanımlanabileceği bir agarose jel üzerinde çözülür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Reaktif | [Son] |
| Kartal | 50 mM |
| Tris-HCl pH 8.3 | 10 mM |
| MgCl2 | 2,5 mM |
| NP-40 | 0.45% |
| Ara-20 | 0.45% |
| Proteinaz K | 1 mg/mL |
Tablo 1. Solucan Liziz Tampon Tarifi. Proteinaz K her kullanımdan önce taze eklenmelidir.
| Reaktif | 1x | 24x |
| 2X Q5 Mastermix | 12,5 μL | 300 μL |
| Astar F1 (10 μM) | 1,25 μL | 30 μL |
| Astar R1 (10 μM) | 1,25 μL | 30 μL |
| Solucan Lizisi | 4 μL | ---- |
| ddH2O | 6 μL | 144 μL |
| Son Ses Düzeyi | 25 μL | 504 μL |
Tablo 2. PCR Mastermix. PCR mastermiksi, çözelti homojen olana kadar pipetleme ile iyice karıştırılmalıdır. Temiz PCR tüplerine 21 μL PCR mastermiksi eklenmeli ve daha sonra düzgün etiketlenmiş tüplere 4 μL bireysel solucan lysate eklenmelidir.
| Reaktif | 1x | 24x |
| 10X Enzim Tamponu | 2 μL | 48 μL |
| Temizlenmiş PCR Reaksiyon | 10 μL | ---- |
| ddH2O | 7 μL | 168 μL |
| Kısıtlama Enzimi (10 U/μL) | 1 μL | 24 μL |
| Son Ses Düzeyi | 20 μL | 240 μL |
Tablo 3. Kısıtlama Enzim Mastermiksi. Kısıtlama enzimi mastermiksi, çözelti homojen olana kadar pipetleme ile iyice karıştırılmalıdır. 10 μL'lik temizlenmiş PCR ürününe kısıtlama enzimi mastermiksinin 10 μL'si eklenmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nuclease-free water | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4004 | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0494L | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| MgCl2 | Sigma | M2393 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| RNaseZap Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 |
