Denne protokollen er et utdrag fra Escorcia et al, Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining, J. Vis. Exp. (2018).
1. Nil rød (NR) Farging av lipider
- Tilberedning av 5 mg/ml NR-lagerløsning
- I en 500 ml flaske tilsettes 100 mg NR-pulver til 200 ml 100 % aceton.
- Dekk flasken med aluminiumsfolie for å unngå eksponering for lys.
- Rør oppløsningen i 2 timer i mørket før bruk.
- Oppbevar NR-lagerløsningen på lang sikt i en tett forseglet flaske uten lyseksponering. Skaler NR-lagerløsningen etter forskningsbehov. Sørg for at den samme lagerløsningen brukes på tvers av NR-fargeeksperimenter for å oppnå konsistente farge- og bilderesultater.
- Utarbeidelse av NR arbeidsløsning
- For hver 1 ml 40 % isopropanol (v/v) tilsett 6 μL NR-lagerløsning.
- Forbered 600 μL NR-arbeidsløsning for hver prøve.
MERK: Lag fersk NR-arbeidsløsning rett før farging. Avhengig av NR-lagerløsningsbehov, bruk enten et 15 ml eller 50 ml gradert konisk rør.
- Fremstilling av ormer for NR lipidfarging
- Vokse ormer til tidlig L4 stadium ved 20 °C på nematode vekst medium (NGM) frø med sen-logg OP50 E. coli.
- Vask ormene av platen med 1 ml 1x fosfatbufret saltvann + 0,01% Triton X-100 (PBST) løsning og legg ormeopphenget i et 1,5 ml mikrofugerør.
- Sentrifuger ormene på 560 x g i 1 min. Fjern supernatanten og gjenta dette trinnet til E. coli er fjernet fra suspensjon.
- Tilsett 100 μL 40% isopropanol til ormepellet og inkuber den ved romtemperatur i 3 min.
- Sentrifuger ormene på 560 x g i 1 min og fjern supernatanten uten å forstyrre ormepellet.
MERK: Bruk høyere volumer av PBST for å vaske ormene av platene hvis du bruker større plater eller flekker flere ormer per plate. Ikke vask ormene i PBST mer enn 15 minutter før prøvefikseringen. Utfør ekstra vasker hvis supernatanten ikke er ryddet av bakterier. Utfør inkubasjonen i 40% isopropanol ved hjelp av en mutter eller rocker. Overvåk alltid rørene for å sikre at full prøve agitasjon oppstår.
- Lipidfarging med NR
- I mørket legger du til 600 μL NR-arbeidsløsning i hver prøve. Snu rørene tre ganger og bland ormene helt i NR-oppløsning.
- Roter prøven i mørket ved romtemperatur i 2 timer.
- Etter inkubasjonen sentrifugerer du ormene på 560 x g i 1 min og fjerner supernatanten.
- Tilsett 600 μL PBST og inkuber prøvene i mørket i 30 min for å fjerne overflødig NR-flekk.
- Sentrifuger prøvene ved 560 x g i 1 min og fjern alle unntatt ca. 50 μL supernatant.
MERK: NR-inkubasjon krever ikke agitasjon. Oppgjør av ormer er vanlig i dette trinnet.
- Forberedelse av lysbilder for mikroskopavbildning
- Resuspend ormepellet i gjenværende supernatant.
- Plasser 5 μL ormfjæring på et mikroskopsklie og sett på en deksleslip på forsiktig for å unngå å fange luftbobler.
- Forsegle dekslene med neglelakk før bildebehandling av ormer.
- Forbered bare et par lysbilder om gangen. Dette vil sikre at NR-avbildningen forblir konstant på tvers av prøver. Kvaliteten på NR-fargede bilder avtar etter 6 timer. Diskrete lipiddråper er vanskelige å observere og bakgrunnsfluorescens øker, noe som forstyrrer NR-signaldeteksjonen.
- Avbildning av NR-fargede ormer
- Bilde ormene med 5X forstørrelse for å fange flere dyr per synsfelt.
- Bytt til 10X forstørrelse for bedre kvantifisering av individuelle ormer.
- Bruk FITC/GFP-kanalen til å avbilde NR-fargede ormer og prøv forskjellige eksponeringstider for å bestemme de optimale betingelsene for kvantifisering.
- Lagre filer i TIF-format for å unngå å miste data på grunn av komprimering.
MERK: Typiske eksponeringstider varierer fra 100-1000 ms. Hvis du har optimal eksponeringstid, bruker du den til alle prøver for å opprettholde bildekonsistensen.
