Detta protokoll är ett utdrag från Escorcia et al, Quantification of Lipid Abundance och Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans av Nile Red and Oil Red O Staining, J. Vis. Exp. (2018).
1. Nilröd (NR) Färgning av lipider
- Beredning av 5 mg/ml NR-stamlösning
- I en 500 ml flaska, tillsätt 100 mg NR pulver till 200 ml 100% aceton.
- Täck flaskan med aluminiumfolie för att undvika exponering för ljus.
- Rör om lösningen i 2 timmar i mörker före användning.
- För långvarig användning, förvara NR-stamlösningen i en tätt förseglad flaska utan ljusexponering. Skala NR-lagerlösningen enligt forskningsbehov. Se till att samma stamlösning används i NR-färgningsexperiment för att uppnå konsekventa färgnings- och bildresultat.
- Förberedelse av NR-arbetslösning
- För varje 1 ml 40% isopropanol (v/v), tillsätt 6 μL NR-stamlösning.
- Förbered 600 μL NR-arbetslösning för varje prov.
OBS: Gör fräsch NR-arbetslösning precis före färgning. Beroende på NR-lagerlösningsbehov, använd antingen ett 15 ml eller 50 ml graderat koniskt rör.
- Förberedelse av maskar för NR lipidfärgning
- Odla maskar till tidigt L4-stadium vid 20 °C på nematodtillväxtmedium (NGM) sådd med senlogg OP50 E. coli.
- Tvätta maskarna från plattan med 1 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning + 0,01% Triton X-100 (PBST) lösning och sätt maskfjädringen i ett 1,5 ml mikrofugerör.
- Centrifugera maskarna vid 560 x g i 1 min. Ta bort supernatanten och upprepa detta steg tills E. coli rensas från suspension.
- Tillsätt 100 μL 40% isopropanol till maskpelleten och inkubera den vid rumstemperatur i 3 min.
- Centrifugera maskarna vid 560 x g i 1 min och ta bort supernatanten utan att störa maskpelleten.
OBS: Använd högre volymer PBST för att tvätta maskarna från plattorna om du använder större plattor eller färgar fler maskar per tallrik. Tvätta inte maskarna i PBST mer än 15 minuter före provfixeringen. Utför ytterligare tvättar om supernaten inte rensas från bakterier. Utför inkubationen i 40% isopropanol med en mutter eller vipp. Övervaka alltid rören för att se till att full provröritation sker.
- Lipidfärgning med NR
- Lägg i mörker till 600 μL NR-arbetslösning till varje prov. Vänd rören tre gånger och blanda maskarna helt i NR-lösningen.
- Rotera provet i mörker vid rumstemperatur i 2 timmar.
- Efter inkubationen, centrifugera maskarna vid 560 x g i 1 min och ta bort supernatanten.
- Tillsätt 600 μL PBST och inkubera proverna i mörker i 30 minuter för att avlägsna överflödig NR-fläck.
- Centrifugera proverna vid 560 x g i 1 min och ta bort alla utom cirka 50 μL supernatant.
OBS: NR-inkubation kräver inte agitation. Sedimentering av maskar är vanligt under detta steg.
- Förberedelse av diabilder för mikroskopavbildning
- Återanvänd maskpelleten i återstående supernatant.
- Placera 5 μL maskfjädring på en mikroskopbild och sätt på ett täckglas noggrant för att undvika att fånga luftbubblor.
- Försegla täcket med nagellack innan du avbildar maskar.
- Förbered bara ett par bilder i taget. Detta säkerställer att NR-avbildningen förblir konstant över olika prover. Kvaliteten på NR-färgade bilder minskar efter 6 h. Diskreta lipiddroppar är svåra att observera och bakgrundsfluorescensen ökar, vilket stör NR-signaldetektering.
- Bildbehandling av NR-färgade maskar
- Avbilda maskarna vid 5X förstoring för att fånga flera djur per synfält.
- Byt till 10X förstoring för bättre kvantifiering av enskilda maskar.
- Använd FITC/GFP-kanal för att avbilda NR-färgade maskar och prova olika exponeringstider för att bestämma de optimala förutsättningarna för kvantifiering.
- Spara filer i TIF-format för att undvika att förlora data på grund av komprimering.
OBS: Typiska exponeringstider varierar från 100-1000 ms. Med optimal exponeringstid, använd den för alla prover för att upprätthålla bildkonsistens.
