Nilröd färgning av C. elegans: En metod för att visualisera lipiddroppar hos fasta djur

Overview

Den här videon beskriver ett protokoll för att färga lipider i hela, fasta maskar med Nile Red färgämne.  För att specifikt se de neutrala lipiderna i kärnan av lipiddroppar, avbilda det gröna utsläppsspektrat av den färgade C. elegans.

Protocol

Detta protokoll är ett utdrag från Escorcia et al, Quantification of Lipid Abundance och Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans av Nile Red and Oil Red O Staining, J. Vis. Exp. (2018).

1. Nilröd (NR) Färgning av lipider

1. Beredning av 5 mg/ml NR-stamlösning
   1. I en 500 ml flaska, tillsätt 100 mg NR pulver till 200 ml 100% aceton.
   2. Täck flaskan med aluminiumfolie för att undvika exponering för ljus.
   3. Rör om lösningen i 2 timmar i mörker före användning.
   4. För långvarig användning, förvara NR-stamlösningen i en tätt förseglad flaska utan ljusexponering. Skala NR-lagerlösningen enligt forskningsbehov. Se till att samma stamlösning används i NR-färgningsexperiment för att uppnå konsekventa färgnings- och bildresultat.
2. Förberedelse av NR-arbetslösning
   1. För varje 1 ml 40% isopropanol (v/v), tillsätt 6 μL NR-stamlösning.
   2. Förbered 600 μL NR-arbetslösning för varje prov.
      OBS: Gör fräsch NR-arbetslösning precis före färgning. Beroende på NR-lagerlösningsbehov, använd antingen ett 15 ml eller 50 ml graderat koniskt rör.
3. Förberedelse av maskar för NR lipidfärgning
   1. Odla maskar till tidigt L4-stadium vid 20 °C på nematodtillväxtmedium (NGM) sådd med senlogg OP50 E. coli.
   2. Tvätta maskarna från plattan med 1 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning + 0,01% Triton X-100 (PBST) lösning och sätt maskfjädringen i ett 1,5 ml mikrofugerör.
   3. Centrifugera maskarna vid 560 x g i 1 min. Ta bort supernatanten och upprepa detta steg tills E. coli rensas från suspension.
   4. Tillsätt 100 μL 40% isopropanol till maskpelleten och inkubera den vid rumstemperatur i 3 min.
   5. Centrifugera maskarna vid 560 x g i 1 min och ta bort supernatanten utan att störa maskpelleten.
      OBS: Använd högre volymer PBST för att tvätta maskarna från plattorna om du använder större plattor eller färgar fler maskar per tallrik. Tvätta inte maskarna i PBST mer än 15 minuter före provfixeringen. Utför ytterligare tvättar om supernaten inte rensas från bakterier. Utför inkubationen i 40% isopropanol med en mutter eller vipp. Övervaka alltid rören för att se till att full provröritation sker.
4. Lipidfärgning med NR
   1. Lägg i mörker till 600 μL NR-arbetslösning till varje prov. Vänd rören tre gånger och blanda maskarna helt i NR-lösningen.
   2. Rotera provet i mörker vid rumstemperatur i 2 timmar.
   3. Efter inkubationen, centrifugera maskarna vid 560 x g i 1 min och ta bort supernatanten.
   4. Tillsätt 600 μL PBST och inkubera proverna i mörker i 30 minuter för att avlägsna överflödig NR-fläck.
   5. Centrifugera proverna vid 560 x g i 1 min och ta bort alla utom cirka 50 μL supernatant.
      OBS: NR-inkubation kräver inte agitation. Sedimentering av maskar är vanligt under detta steg.
5. Förberedelse av diabilder för mikroskopavbildning
   1. Återanvänd maskpelleten i återstående supernatant.
   2. Placera 5 μL maskfjädring på en mikroskopbild och sätt på ett täckglas noggrant för att undvika att fånga luftbubblor.
   3. Försegla täcket med nagellack innan du avbildar maskar.
   4. Förbered bara ett par bilder i taget. Detta säkerställer att NR-avbildningen förblir konstant över olika prover. Kvaliteten på NR-färgade bilder minskar efter 6 h. Diskreta lipiddroppar är svåra att observera och bakgrundsfluorescensen ökar, vilket stör NR-signaldetektering.
6. Bildbehandling av NR-färgade maskar
   1. Avbilda maskarna vid 5X förstoring för att fånga flera djur per synfält.
   2. Byt till 10X förstoring för bättre kvantifiering av enskilda maskar.
   3. Använd FITC/GFP-kanal för att avbilda NR-färgade maskar och prova olika exponeringstider för att bestämma de optimala förutsättningarna för kvantifiering.
   4. Spara filer i TIF-format för att undvika att förlora data på grund av komprimering.
      OBS: Typiska exponeringstider varierar från 100-1000 ms. Med optimal exponeringstid, använd den för alla prover för att upprätthålla bildkonsistens.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Imager.M2m Microscope	Zeiss	n/a	Fluorescence microscope
ERC5s camera	Axiocam	n/a	Color-capable
MRm camera	Axiocam	n/a	Fluorescence-capable
Nile red	Thermo Fisher	N1142	Lipid Stain
Isopropyl Alcohol	BDH	BDH1133-1LP	Fixative solution
Centrifuge 5430	Eppendorf	5428000015	Centrifuge
Tube Rotator	VWR	10136-084	Rotator