Siminducerad förlamning (SWIP) Analys: En metod för att kvantifiera dopaminmedierad rörelse i C. elegans

Overview

Här introducerar vi en analys för att mäta SWIP, en beteendemässig fenotyp av C. elegans som uppstår under kraftfull rörelse som simning.  Exempelprotokollet diskuterar både manuella och automatiserade analysmetoder.

Protocol

Följande protokoll är ett utdrag från Kudumala et al, Simning inducerad förlamning för att bedöma dopamin signalering i Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).

SWIP (swip)

OBS: Vi beskriver den manuella metoden för att bedöma SWIP i vilda maskar behandlas med AMPH. Vi diskuterar också kort spårning av maskar och ytterligare analys av maskkinetik med hjälp av en automatiserad maskspårare och en spårningsprogramvara som tidigare beskrevs av Hardaway et al.

1. Manuell metod för att testa för SWIP
   1. Aliquot 40 μL 200 mOsm/L sackaroslösning antingen med eller utan 0,5 mM AMPH i en glasfläcksplatta. Under stereoskopet väljer du 8-10 sena L4-scenmaskar med en ögonfrans eller platinaplockning och nedsänker plockningen i plattan som innehåller lösningen tills maskar flyttar av plockningen och simmar in i lösningen. Notera antalet maskar som plockas i brunnen, starta timern, observera och registrera antalet maskar som uppvisar SWIP vid varje minutmarkering.
   2. Kopiera rådata till ett kalkylblad och beräkna procenten av maskar som är förlamade genom att dividera antalet maskar som förlamas varje minut med totalt antal maskar som testats under hela analysen och multipliceras med 100. Kopiera procentvärdena till alla grafer och statistisk programvara och rita data med procentvärden på Y-axeln och tid på X-axeln med XY-diagramformatet.
   3. Utför tvåvägs ANOVA följt av post hoc-analys (t.ex. Bonferroni efter testet) för att testa för statistisk signifikans mellan kontroll, AMPH-grupper och behandlingstid.
2. Automatiserad analys av SWIP
   1. Utför automatiserad analys på en enda mask i taget. Protokollet för att ställa in kamera, worm tracker programvara och skript för att köra spårning programvara analys beskrivs i detalj i Hardaway et al.
   2. Kort, placera en enda sen L4-steg hermafrodit i en glasfläckplatta med hjälp av en ögonfransplockning, enligt beskrivningen i den manuella metoden i avsnitt 1.1.2. Spela in simvideor av en mask vid den tiden och använd worm tracker-programvaran för att beräkna frekvensen av kroppsböjningar.
   3. Följ skriptet som medföljer spårningsprogrammet för att få mask thrashing frekvens och för att generera värme kartor från mask thrashing data.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphetamine	Sigma	51-63-8
Depression glass spot plate	Corning	Corning, Inc. 722085
Eye lash
Graphing and statistical software	Prism		Graphpad 5
Osmometer	Advanced Instruments, Inc	Model 3320
Spreadsheet	MS office		Microsoft Excel
Stereo Microscope	Zeiss	Model tlb3. 1 stemi2000
Sucrose	Sigma-Aldrich	RB=S5016
Superglue	Loctite	1647358 .14 oz.
SwimR sofware	10.18129/B9.bioc.SwimR
Tracker 2	Worm Tracker 2.0	www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/
Video recording software	Virtualdub	http://www.virtualdub.org/