RNAi Plating voor C. elegans Feeding: Een techniek om doel dsRNA expressie te induceren in E. coli

Overview

Deze video beschrijft de principes achter de RNAi-behandeling bij C. elegans en demonstreert een protocol om lin-35 in een transgene wormstam neer te slaan.

Protocol

Dit protocol is overgenomen uit Kolundzic, et al, Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans, J. Vis. Exp. (2018).

1. Oplossingsvoorbereiding
   1. NGM-Agar platen (1 L)
      1. Voeg 3 g NaCl, 2,5 g pepton media (bijv. Bacto-Peptone) en 20 g agar toe. Voeg na autoclaaf 1 ml cholesterol toe (5 mg/ml in 95% EtOH-voorraad), 1 ml van 1 M MgSO_4,1 ml van 1 M CaCl2, 25 ml van 1 M K2PO₄en 1 ml amfotericine B (2,5 mg/ml voorraad).
   2. NGM-Agar RNAi platen (1 L)
      1. Voeg 3 g NaCl, 2,5 g pepton media en 20 g agar toe. Na autoclaaf toevoegen, 1 ml cholesterol (5 mg/ml in 95% EtOH-voorraad), 1 ml van 1 M MgSO_4,1 ml van 1 M CaCl2, 25 ml van 1 M K₂PO_4,1 ml amphotericine B (2,5 mg/ml voorraad), 1 ml 1 M IPTG en 1 ml carblon.
   3. LB-Agar (1 L)
      1. Voeg 10 g pepton media, 5 g gistextract, 5 g NaCl, 20 g agar, 10 ml 1 M Tris pH 8.0 toe. Voeg H₂O toe aan 1 L. Voeg na autoclaaf 1 ml carbenicilline van 50 mg/ml en 2,5 ml tetracycline van 5 mg/ml toe.
   4. LB Medium (1 L)
      1. Voeg 10 g pepton media, 5 g gistextract, 5 g NaCl en 10 ml 1 M Tris pH 8.0 toe. Voeg H₂O toe aan 1 L. Voeg na autoclaaf 1 ml carbenicilline van 50 mg/ml toe.
   5. M9-buffer (1 L)
      1. Voeg 6,0 g Na₂HPO_4,3 g KH₂PO_4,5 g NaCl en 50 mg gelatine toe. Voeg voor gebruik 1 ml 1 M MgSO_{4 toe.}
   6. Bleekoplossing (10 ml)
      1. Voeg 1 ml NaClO en 2 ml 5 N NaOH toe. Voeg H2O toe aan 10 ml.
2. Voorbereiding van RNAi-platen
   OPMERKING: C. elegans wordt meestal gekweekt in het laboratorium op 6 cm Petri platen met 7,5 ml Nematode Growth Medium Agar (NGM-Agar). Dit protocol is geoptimaliseerd voor wormen die op 15 °C worden gehouden. Gebruik standaard steriele technieken om schimmel- en bacteriële besmetting te voorkomen om platen met NGM te bereiden. Hieronder volgt het protocol voor het bereiden van NGM-platen aangevuld met reagentia voor RNAi.
   1. Bereid 6 cm NGM-Agar RNAi platen met 1 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) en 50 μg/ml carbenicilline. Laat ze 24 – 48 uur drogen bij kamertemperatuur in het donker¹².
      1. Houd RNAi platen op 4 °C in het donker. Niet gebruiken als het ouder is dan 14 dagen.
   2. Selecteer de RNAi-bacterie (Escherichia coli HT115) kloon die de L4440 plasmide met de lin-53 gen DNA-sequentie bevat uit de bevroren glycerolvoorraad uit de beschikbare RNAi-bibliotheek op LB-agarplaten met 50 μg/ml carbenicilline en 12,5 μg/ml tetracycline met behulp van het driefasige strepenpatroon. Kweek de bacteriën 's nachts bij 37 °C. Deze kloon maakt IPTG-afhankelijke productie van lin-53 dsRNA in de bacteriën mogelijk.
      1. Kweek bovendien RNAi-bacteriën die de L4440 plasmide bevatten zonder enige gensequentie als de lege vectorcontrole.
   3. Kies de volgende dag een enkele kolonie uit lin-53 of lege vector LB-agar platen met behulp van een pipetpunt van 200 μL en ent elk van hen in een afzonderlijke kweekbuis met 2 ml vloeibaar LB-medium aangevuld met 50 μg/ml carbenicilline. Kweek culturen 's nachts bij 37 °C tot ze een optische dichtheid (OD) bereiken bij 600 nm van 0,6 – 0,8. Meet de OD met behulp van een spectrofotometer.
      LET OP: De vloeibare LB-media mogen geen tetracycline bevatten in tegenstelling tot de LB-agarplaat die wordt gebruikt voor het strepen van de bacteriën uit de glycerolvoorraad, omdat opname van tetracycline tijdens het voeren leidt tot een verminderde RNAi-efficiëntie.
   4. Voeg 500 μL van elke bacteriecultuur(lin-53 of lege vector) toe aan 6 cm NGM-Agar RNAi platen met behulp van een multipipet. Incubeer borden met een gesloten deksel 's nachts bij kamertemperatuur in het donker om te drogen. Gedurende deze tijd zal de IPTG in de NGM-platen de productie van dsRNA in de bacteriën induceren.
      1. Gebruik minimaal 3 platen per bacteriecultuur per experiment. Dit levert 3 technische replica's op voor elk experiment.
   • Bewaar gedroogde NGM-agar RNAi platen met bacteriën bij 4 °C in het donker gedurende maximaal twee weken.
3. Voorbereiding van C. elegans Strain BAT28
4. Behoud de wormstam BAT28 met de transgenes otIs305 [hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)] en ntIs1 [gcy-5prom::gfp] op OP50 bacteriën met behulp van standaard NGM-Agar platen bij 15 °C.
   OPMERKING: Voor gedetailleerd protocol over de Nematodencultuur, zie. De rol-6(su1006) is een dominant allel en veelgebruikt fenotypische injectiemarker¹⁶ die de typische rolbeweging veroorzaakt. Het wordt gebruikt in de otIs305 transgene om hsp-16.2prom::che-1te volgen.
   1. Houd de BAT28-stam te allen tijde op 15 °C om precautious activering van de hsp-16.2prom::che-1 transgene te voorkomen. Verminder de blootstelling aan temperaturen hoger dan 15 °C terwijl u zoveel mogelijk met de belasting omgaat.
5. Gebruik de bleektechniek om wormen te leeftijdssynchronren.
   1. Was 6 cm NGM-Agar platen met volwassenen en eieren van BAT28 af met een buffer van 900 μL M9. Pelletwormen door centrifugeren bij 900 x g gedurende 1 min. Verwijder het supernatant.
   2. Voeg 0,5 – 1 ml bleekoplossing toe en schud de buis ongeveer 1 minuut totdat volwassen wormen open beginnen te barsten. Monitor met behulp van een standaard stereomicroscoop.
   3. Pelletwormen door centrifugeren bij 900 x g gedurende 1 min. Verwijder het supernatant.
   4. Was de wormkorrel 3 keer door 800 μL M9-buffer toe te voegen en centrifugeren op 900 x g.
   5. Leg de gereinigde eieren op verse NGM-platen gezaaid met OP50 bacteriën. Kweek een gebleekte populatie op OP50-bacteriën bij 15 °C tot ze het L4-stadium bereiken (ongeveer 4 dagen). L4-larven zijn te herkennen aan een witte vlek ongeveer halverwege de ventrale kant van de worm met behulp van een standaard stereomicroscoop.
      OPMERKING: Om de kiemcel naar neuronconversiefenotype te bereiken bij uitputting van lin-53,moet deze worden uitgeput in de ouderlijke generatie (P0). De score voor het conversiefenotype wordt uitgevoerd in de volgende generatie (filial generatie F1). Om de uitgeputte lin-53 al in de P0 te bereiken, worden L4-dieren onderworpen aan RNAi.
6. Breng handmatig 50 L4-fase wormen per replica over met behulp van een platinadraad naar een NGM-plaat die geen bacteriën bevat en laat wormen wegtrekken van overgedragen OP50-bacteriën. Laat wormen ongeveer 5 minuten op de plaat bewegen. Gebruik bacteriën uit de NGM-Agar RNAi platen die eerder zijn gezaaid met lin-53 RNAi bacteriën (of lege vector controle) om over te brengen naar de respectievelijke RNAi platen.
   1. Vermijd het overbrengen van OP50-bacteriën naar de eigenlijke RNAi-platen. Werk snel om de blootstellingstijd van de belasting tot temperaturen hoger dan 15 °C te minimaliseren.
7. Incubeer wormen op NGM-Agar RNAi platen bij 15 °C gedurende ongeveer 7 dagen totdat F1 nakomelingen van de wormen L3 – L4 stadium bereiken. Ze kunnen duidelijk worden gescheiden van de P0-dieren, omdat ze groter en dikker zijn dan het F1-nageslacht.
   1. Controleer visueel onder een standaard stereomicroscoop of F1-nakomelingenwormen het uitstekende vulva (pvul) fenotype vertonen zoals weergegeven in figuur 1. RNAi tegen lin-53 heeft pleiotrope effecten en veroorzaakt het pvulfenotype dat kan worden gebruikt om te beoordelen of RNAi tegen lin-53 succesvol is geweest.
      OPMERKING:  RNAi tegen lin-53 kan ook dodelijkheid van F1-embryo's veroorzaken. Dit effect neemt toe als platen worden blootgesteld aan hogere graden dan 15 °C voordat dieren de L3 - L4-fase bereiken. Dode embryo's zijn te herkennen aan de gearresteerde ontwikkeling en het gebrek aan uitkomen.
   2. Incubeer platen in het donker omdat IPTG lichtgevoelig is.

Representative Results

Figuur 1: Pvul fenotype veroorzaakt door RNAi tegen lin-53. (Boven) DIC-beeld van L4/young adult stadium F1-nakomelingenwormen afgeleid van controle of lin-53 RNAi behandelde moeders. Schaalbalken = 20 μm. (Onder) Dieren behandeld met lin-53 RNAi geven het uitstekende vulva (pvul) fenotype (zwarte pijlpunten) weer. Het pvul fenotype bevestigt dat RNAi tegen lin-53 succesvol was. Schaalbalken = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Agar-Agar, Kobe I	Roth	5210.1
Bactopeptone	A. Hartenstein GmbH	211 677	Peptone Media
Yeast extract	AppliChem	A1552,0100
Amphotericin B	USBiological	A2220
CaCl2	Merck Biosciences	208290
Cholesterol	Roth	8866.2
Gelatine	Roth	4275.3
IPTG	Sigma	15502-10G
K2PO4	Roth	T875.2
KH2PO4	Roth	3904.2
MgSO4	VWR	25,163,364
Na2HPO4	Roth	P030.1
NaCl	Roth	9265.1
NaClO	Roth	9062.3
NaOH (5 N)	Roth	KK71.1
Tris	Roth	AE15.2
Carbenicillin	Roth	634412
Tetracycline	Roth	2371.2
Incubators
Incubator	Sanyo MIR-5	5534210	for maintenance of worm strains at 15 °C or 25 °C
Microscopes
Stereomicroscope	SMZ745	Nikon
Bacterial strains
Escherichia coli HT115			F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5promoter -T7 polymerase) (IPTG-inducible T7 polymerase) (RNAseIII minus).
Escherichia coli OP50			Uracil auxotroph E. coli strain
Worm strains
BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1::3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.			derived from OH9846 by 4x times more back crossing with N2
RNAi Clones
lin-53	SourceBioscience	ID I-4D14	Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12
empty vetor: L4440	Addgene	#1654