RNAi Plating for C. elegans Feeding: A Technique to Induce Target dsRNA Expression in E. coli

Overview

Dieses Video beschreibt die Prinzipien hinter der RNAi-Behandlung in C. elegans und zeigt ein Protokoll zum Knockdown von lin-35 in einem transgenen Wurmstamm.

Protocol

Dieses Protokoll ist aus Kolundzic, et al, Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression zur Neuprogrammierung von Keimzellen auf Neuronen in C. elegans, J. Vis. Exp. (2018).

1. Lösungsvorbereitung
   1. NGM-Agar Platten (1 L)
      1. Fügen Sie 3 g NaCl, 2,5 g Peptonmedien (z. B. Bacto-Peptone) und 20 g Agar hinzu. Nach dem Autoklavieren 1 ml Cholesterin (5 mg/ml in 95% EtOH-Lager), 1 ml 1 M MgSO_4,1 ml 1 M CaCl2, 25 ml von 1 M K2PO₄und 1 ml Amphotericin B (2,5 mg/ml Vorrat) hinzufügen.
   2. NGM-Agar RNAi Platten (1 L)
      1. 3 g NaCl, 2,5 g Peptonmedien und 20 g Agar hinzufügen. Nach dem Autoklavieren 1 ml Cholesterin (5 mg/ml in 95% EtOH-Bestand), 1 ml 1 M MgSO_4,1 ml von 1 M CaCl2, 25 ml von 1 M K₂PO₄, 1 ml Amphotericin B (2,5 mg/ml Vorrat), 1 ml 1 M IPTG und 1 ml Carbenicillin (50 mg/ml).
   3. LB-Agar (1 L)
      1. 10 g Peptonmedien, 5 g Hefeextrakt, 5 g NaCl, 20 g Agar, 10 ml 1 M Tris pH 8,0 hinzufügen. H₂O zu 1 L hinzufügen. Nach dem Autoklavieren 1 ml 50 mg/ml Carbenicillin und 2,5 ml Tetracyclin hinzufügen.
   4. LB Medium (1 L)
      1. 10 g Peptonmedien, 5 g Hefeextrakt, 5 g NaCl und 10 ml 1 M Tris pH 8.0 hinzufügen. H₂O zu 1 L hinzufügen. Nach dem Autoklavieren 1 ml 50 mg/ml Carbenicillin hinzufügen.
   5. M9-Puffer (1 L)
      1. Fügen Sie 6,0 g Na₂HPO₄, 3 g KH₂PO₄, 5 g NaCl und 50 mg Gelatine hinzu. Vor der Verwendung 1 ml von 1 M MgSO₄hinzufügen.
   6. Bleichlösung (10 ml)
      1. 1 ml NaClO und 2 ml von 5 N NaOH hinzufügen. H2O auf 10 ml hinzufügen.
2. Herstellung von RNAi-Platten
   HINWEIS: C. elegans wird typischerweise im Labor auf 6 cm Petriplatten kultiviert, die 7,5 ml Nematode Growth Medium Agar (NGM-Agar) enthalten. Dieses Protokoll ist für Würmer optimiert, die bei 15 °C gehalten werden. Um Platten mit NGM herzustellen, verwenden Sie standardsterile Techniken, um Pilz- und Bakterienkontamination zu verhindern. Im Folgenden finden Sie das Protokoll zur Herstellung von NGM-Platten, die mit Reagenzien für RNAi ergänzt werden.
   1. Bereiten Sie 6-cm NGM-Agar RNAi Platten mit 1 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) und 50 g/ml Carbenicillin vor. Lassen Sie sie für 24 – 48 h bei Raumtemperatur im Dunkeln¹²trocknen.
      1. RNAi-Platten bei 4 °C im Dunkeln aufbewahren. Nicht verwenden, wenn älter als 14 Tage.
   2. Wählen Sie den RNAi-Bakterien -Escherichia coli HT115) Klon, der das L4440-Plasmid mit der Lin-53-Gen-DNA-Sequenz aus dem gefrorenen Glyzerinbestand enthält, aus der verfügbaren RNAi-Bibliothek auf LB-Agar-Platten, die 50 g/ml Carbenicillin und 12,5 g/ml Tetracyclin enthalten, unter Verwendung des dreiphasigen Streifenmusters. Wachsen Sie die Bakterien bei 37 °C über Nacht. Dieser Klon ermöglicht die IPTG-abhängige Produktion von lin-53 dsRNA in den Bakterien.
      1. Zusätzlich wachsen RNAi-Bakterien, die das L4440-Plasmid enthalten, ohne Gensequenz als leere Vektorkontrolle.
   3. Am nächsten Tag wählen Sie eine einzelne Kolonie aus lin-53 oder leeren Vektor-LB-Agar-Platten mit einer 200-L-Pipettenspitze und impfen Sie jede von ihnen in ein separates Kulturrohr mit 2 ml flüssigem LB-Medium, ergänzt mit 50-g/ml Carbenicillin. Wachsen Sie Kulturen über Nacht bei 37 °C, bis sie eine optische Dichte (OD) bei 600 nm von 0,6 – 0,8 erreichen. Messen Sie die OD mit einem Spektralphotometer.
      VORSICHT: Die flüssigen LB-Medien sollten Tetracyclin nicht enthalten, im Gegensatz zur LB-Agar-Platte, die zum Streichen der Bakterien aus dem Glycerinbestand verwendet wird, da die Aufnahme von Tetracyclin während der Fütterung zu einer verminderten RNAi-Effizienz führt.
   4. Fügen Sie mit einer Multipipette 500 l jeder Bakterienkultur(lin-53 oder leerer Vektor) zu 6 cm NGM-Agar RNAi-Platten hinzu. Inkubieren Sie Platten mit einem geschlossenen Deckel über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln zum Trocknen. Während dieser Zeit wird die IPTG in den NGM-Platten die Produktion von dsRNA in den Bakterien induzieren.
      1. Verwenden Sie mindestens 3 Platten pro Bakterienkultur pro Experiment. Dadurch werden 3 technische Replikationen für jedes Experiment zur Verfügung stellen.
   • Getrocknete NGM-Agar RNAi-Platten mit Bakterien bei 4 °C im Dunkeln bis zu zwei Wochen lagern.
3. Vorbereitung von C. elegans Strain BAT28
4. Bewahren Sie den Wurmstamm BAT28, der die Transgene otIs305 [hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)] und ntIs1 [gcy-5prom::gfp] auf OP50-Bakterien mit Standard-NGM-Agar-Platten bei 15 °C enthält.
   HINWEIS: Ausführliches Protokoll zur Nematode-Kultur finden Sie unter. Die rol-6(su1006) ist ein dominantes Allel und häufig verwendete phänotypische Injektionsmarker^16, die die typische Rollbewegung verursacht. Es wird im otIs305-Transgen verwendet, um hsp-16.2prom::che-1zu verfolgen.
   1. Halten Sie die BAT28-Sorte jederzeit bei 15 °C, um eine vorbeugende Aktivierung des hsp-16.2prom::che-1 Transgens zu verhindern. Reduzieren Sie die Exposition gegenüber Temperaturen über 15 °C, während Sie die Belastung so weit wie möglich behandeln.
5. Um Würmer alterssynchron zu synchronisieren, verwenden Sie die Bleichtechnik.
   1. 6 cm NGM-Agar-Platten mit Erwachsenen und Eiern von BAT28 mit 900 L M9 Puffer abwaschen. Pelletwürmer durch Zentrifugieren bei 900 x g für 1 min. Entfernen Sie den Überstand.
   2. Fügen Sie 0,5 – 1 ml Bleichlösung hinzu und schütteln Sie das Rohr ca. 1 min, bis erwachsene Würmer zu platzen beginnen. Monitor mit einem Standard-Stereomikroskop.
   3. Pelletwürmer durch Zentrifugieren bei 900 x g für 1 min. Entfernen Sie den Überstand.
   4. Waschen Sie das Wurmpellet 3 mal, indem Sie 800 l M9-Puffer und Zentrifugieren bei 900 x g hinzufügen.
   5. Die gereinigten Eier auf frische NGM-Platten legen, die mit OP50-Bakterien gesät sind. Wachsen Sie eine gebleichte Population auf OP50-Bakterien bei 15 °C, bis sie l4-Stadium (ca. 4 Tage) erreichen. L4-Larven können durch einen weißen Fleck etwa auf halbem Weg entlang der ventralen Seite des Wurms mit einem Standard-Stereomikroskop erkannt werden.
      HINWEIS: Um die Keimzelle zu Neuronumwandlung Phänotyp bei Erschöpfung von lin-53zu erreichen, muss es in der elterlichen Generation (P0) erschöpft werden. Die Bewertung für den Umwandlungsphänotyp erfolgt in der folgenden Generation (Filialgeneration F1). Um das erschöpfende lin-53 bereits im P0 zu erreichen, werden L4-Tiere RNAi unterworfen.
6. Übertragen Sie 50 L4-Bühnenwürmer pro Replikation manuell mit einem Platindraht auf eine NGM-Platte, die keine Bakterien enthält, und lassen Sie Würmer sich von allen übertragenen OP50-Bakterien entfernen. Lassen Sie Würmer für ca. 5 Minuten auf dem Teller bewegen. Verwenden Sie Bakterien aus den NGM-Agar RNAi-Platten, die zuvor mit lin-53 RNAi-Bakterien (oder leerer Vektorkontrolle) gesät wurden, um sie auf die jeweiligen RNAi-Platten zu übertragen.
   1. Vermeiden Sie die Übertragung von OP50-Bakterien auf die eigentlichen RNAi-Platten. Arbeiten Sie schnell, um die Belichtungszeit der Belastung bei Temperaturen über 15 °C zu minimieren.
7. Inkubieren Sie Würmer auf NGM-Agar RNAi Platten bei 15 °C für ca. 7 Tage, bis die F1-Nachkommenschaft der Würmer die L3-L4-Stufe erreicht. Sie können deutlich von den P0-Tieren getrennt werden, da sie größer und dicker als die F1-Nachkommen sind.
   1. Unter einem Standard-Stereomikroskop visuell prüfen, ob F1-Vorläuferwürmer den hervorstehenden Vulva -Pvul) Phänotyp zeigen, wie in Abbildung 1dargestellt. RNAi gegen lin-53 hat pleiotrope Wirkungen und verursacht den Pvul-Phänotyp, der verwendet werden kann, um zu beurteilen, ob RNAi gegen lin-53 erfolgreich war.
      HINWEIS:  RNAi gegen Lin-53 kann auch die Letalität von F1-Embryonen verursachen. Dieser Effekt verstärkt sich, wenn Platten höheren Graden als 15 °C ausgesetzt sind, bevor die Tiere das L3-L4-Stadium erreichten. Tote Embryonen können durch verhaftete Entwicklung und mangels Schlüpfen erkannt werden.
   2. Inkubieren Sie Platten im Dunkeln, da IPTG lichtempfindlich ist.

Representative Results

Abbildung 1: Pvul-Phänotyp, der durch RNAi gegen Lin-53 verursacht wird. (Oben) DIC-Bild von L4/jungen Erwachsenen Stadium F1 Nachkommenwürmer von Kontrolle abgeleitet oder lin-53 RNAi behandelt Mütter. Skalenstäbe = 20 m. (Unten) Tiere, die mit lin-53 RNAi behandelt werden, zeigen den hervorstehenden Vulva (Pvul) Phänotyp (schwarze Pfeilköpfe). Der Pvul-Phänotyp bestätigt, dass RNAi gegen Lin-53 erfolgreich war. Skalenbalken = 20 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Agar-Agar, Kobe I	Roth	5210.1
Bactopeptone	A. Hartenstein GmbH	211 677	Peptone Media
Yeast extract	AppliChem	A1552,0100
Amphotericin B	USBiological	A2220
CaCl2	Merck Biosciences	208290
Cholesterol	Roth	8866.2
Gelatine	Roth	4275.3
IPTG	Sigma	15502-10G
K2PO4	Roth	T875.2
KH2PO4	Roth	3904.2
MgSO4	VWR	25,163,364
Na2HPO4	Roth	P030.1
NaCl	Roth	9265.1
NaClO	Roth	9062.3
NaOH (5 N)	Roth	KK71.1
Tris	Roth	AE15.2
Carbenicillin	Roth	634412
Tetracycline	Roth	2371.2
Incubators
Incubator	Sanyo MIR-5	5534210	for maintenance of worm strains at 15 °C or 25 °C
Microscopes
Stereomicroscope	SMZ745	Nikon
Bacterial strains
Escherichia coli HT115			F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5promoter -T7 polymerase) (IPTG-inducible T7 polymerase) (RNAseIII minus).
Escherichia coli OP50			Uracil auxotroph E. coli strain
Worm strains
BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1::3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.			derived from OH9846 by 4x times more back crossing with N2
RNAi Clones
lin-53	SourceBioscience	ID I-4D14	Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12
empty vetor: L4440	Addgene	#1654