Overview
וידאו זה מתאר את העקרונות מאחורי טיפול RNAi ב C. elegans ומדגים פרוטוקול להפיל לין-35 בזן תולעת מהונדס.
Protocol
פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Kolundzic, ואח ', יישום של RNAi והלם-הלם-induced ביטוי פקטור שעתוק לתכנת מחדש תאי נבט לנוירונים ב C. elegans, J. Vis. Exp. (2018).
- הכנת פתרונות
-
לוחות NGM-אגר (1 ליטר)
- הוסף 3 גרם של NaCl, 2.5 גרם של מדיה פפטון (למשל, בקטו-פפטון), ו 20 גרם של אגר. לאחר autoclaving, להוסיף 1 מ"ל של כולסטרול (5 מ"ג / מ"ל ב 95% מניית EtOH), 1 מ"ל של 1 M MgSO4, 1 מ"ל של 1 M CaCl2, 25 מ"ל של 1 M K2PO4, ו 1 מ"ל של אמפוטריקין B (2.5 מ"ג / מ"ל מלאי).
-
לוחות RNAi NGM-אגר (1 L)
- הוסף 3 גרם של NaCl, 2.5 גרם של מדיה פפטון, ו 20 גרם של אגר. לאחר autoclaving להוסיף, 1 מ"ל של כולסטרול (5 מ"ג / מ"ל ב 95% מניית EtOH), 1 מ"ל של 1 M MgSO4, 1 מ"ל של 1 M CaCl2, 25 מ"ל של 1 M K2PO4, 1 מ"ל של amphotericin B (2.5 מ"ג / מ"ל מלאי), 1 מ"ל של 1 M IPTG, ו 1 מ"ל קרבניצילין (50 מ"ג / מ"ל).
-
ל.ב.-אגר (1 ליטר)
- הוסף 10 גרם של מדיה פפטון, 5 גרם של תמצית שמרים, 5 גרם של NaCl, 20 גרם של אגר, 10 מ"ל של 1 M Tris pH 8.0. הוסף H2O ל 1 L. לאחר אוטוקלאבינג, להוסיף 1 מ"ל של 50 מ"ג / מ"ל קרבניצילין ו 2.5 מ"ל של 5 מ"ג / מ"ל טטרציקלין.
-
LB בינוני (1 L)
- הוסף 10 גרם של מדיה פפטון, 5 גרם של תמצית שמרים, 5 גרם של NaCl, ו 10 מ"ל של 1 M Tris pH 8.0. הוסף H2O ל 1 L. לאחר autoclaving, להוסיף 1 מ"ל של 50 מ"ג / מ"ל קרבניצילין.
-
מאגר M9 (1 L)
- הוסף 6.0 גרם של Na2HPO4, 3 גרם של KH2PO4, 5 גרם של NaCl, ו 50 מ"ג של ג'לטין. לפני השימוש, להוסיף 1 מ"ל של 1 M MgSO4.
-
פתרון הלבנה (10 מ"ל)
- הוסף 1 מ"ל של NaClO ו 2 מ"ל של 5 N NaOH. הוסף H2O ל- 10 מ"ל.
-
לוחות NGM-אגר (1 ליטר)
- הכנת לוחות RNAi
שים לב: C. אלגנס הוא בדרך כלל בתרבית במעבדה על 6 ס"מ צלחות פטרי המכיל 7.5 מ"ל של נמטודה צמיחה בינוני אגר (NGM-אגר). פרוטוקול זה ממוטב לתולעים המוחזקות ב- 15 °C (60 °F). כדי להכין צלחות עם NGM, להשתמש בטכניקות סטריליות סטנדרטיות כדי למנוע זיהום פטרייתי חיידקי. להלן הפרוטוקול להכנת לוחות NGM בתוספת ריאגנטים עבור RNAi.-
הכינו לוחות NGM-אגר RNAi 6 ס"מ המכילים 1 מ"מ איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ו 50 מיקרוגרם / מ"ל קרבניצילין. תן להם להתייבש במשך 24 - 48 שעות בטמפרטורת החדר בחושך12.
- שמור על לוחות RNAi ב 4 מעלות צלזיוס בחושך. אין להשתמש אם יש יותר מ-14 ימים.
-
בחר את חיידק RNAi (Escherichia coli HT115) שיבוט המכיל את פלסמיד L4440 עם רצף DNA גנים לין-53 מתוך מלאי גליצרול קפוא מספריית RNAi זמין על לוחות LB-אגר המכילים 50 מיקרוגרם / מ"ל קרבניצילין ו 12.5 מיקרוגרם / מ"ל טטרציקלין באמצעות פס שלושת השלבים לגדל את החיידקים ב 37 °C (60 °F) לילה. שיבוט זה מאפשר ייצור תלוי IPTG של לין-53 dsRNA בחיידקים.
- בנוסף, לגדל חיידקי RNAi המכילים את פלסמיד L4440 ללא כל רצף גנים כמו שליטה וקטורית ריקה.
- למחרת, לבחור מושבה אחת מן לין-53 או ריק וקטור LB-אגר צלחות באמצעות קצה פיפטה 200 μL ולחסן כל אחד מהם לתוך צינור תרבות נפרד המכיל 2 מ"ל של נוזלי LB בינוני בתוספת 50 מיקרוגרם / מ"ל קרבניצילין. לגדל תרבויות לילה ב 37 °C (67 °F) עד שהם מגיעים צפיפות אופטית (OD) ב 600 ננומטר של 0.6 – 0.8. למדוד את OD באמצעות ספקטרופוטומטר.
התראה: מדיית LB נוזלי לא צריך להכיל טטרציקלין בניגוד צלחת LB-אגר המשמש פסים החיידקים ממלאי גליצרול, מאז הכללת טטרציקלין במהלך האכלה מוביל יעילות RNAi ירד. -
הוסף 500 μL של כל תרבות חיידקים(לין-53 או וקטור ריק) כדי 6 ס"מ NGM-אגר RNAi צלחות באמצעות multipipette. דגירה צלחות עם מכסה סגור לילה בטמפרטורת החדר בחושך לייבוש. במהלך תקופה זו, IPTG בלוחות NGM יגרום לייצור dsRNA בחיידקים.
- יש להשתמש ב-3 צלחות לפחות לתרבית חיידקים לכל ניסוי. פעולה זו תספק 3 משכפלים טכניים עבור כל ניסוי.
- יש לאחסן לוחות RNAi מיובשים ב-NGM-אגר עם חיידקים ב-4°C בחושך עד שבועיים.
-
הכינו לוחות NGM-אגר RNAi 6 ס"מ המכילים 1 מ"מ איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ו 50 מיקרוגרם / מ"ל קרבניצילין. תן להם להתייבש במשך 24 - 48 שעות בטמפרטורת החדר בחושך12.
- הכנת C. אלגנס זן BAT28
- שמור על זן התולעת BAT28 המכיל את transgenes otIs305 [hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)] ו ntIs1 [gcy-5prom::gfp]על חיידקים OP50 באמצעות לוחות NGM-אגר סטנדרטיים ב 15 °C (60 °F).
שים לב: לפרוטוקול מפורט על תרבות נמטודה, ראה. rol-6(su1006) הוא אלל דומיננטי נפוץ סמן הזרקת פנוטיפי16 שגורם לתנועה מתגלגלת טיפוסית. הוא משמש טרנסגן otIs305 כדי לעקוב אחר hsp-16.2prom::che-1.- שמור על זן BAT28 ב 15 מעלות צלזיוס בכל עת על מנת למנוע הפעלה מוקדמת של hsp-16.2prom::che-1 transgene. להפחית את החשיפה לטמפרטורות גבוהות מ 15 °C (60 °F) תוך טיפול בזן ככל האפשר.
- כדי לסנכרן תולעים בגיל, השתמש בטכניקת ההלבנה.
- לשטוף את 6 ס"מ NGM-אגר צלחות המכילות מבוגרים וביצים של BAT28 באמצעות חיץ 900 μL M9. תולעי גלולה על ידי צנטריפוגה ב 900 x g במשך 1 דקות. הסר את העל-טבעי.
- מוסיפים 0.5 – 1 מ"ל של פתרון הלבנה ומנערים את הצינור במשך כ 1 דקות עד תולעים בוגרים מתחילים להתפוצץ פתוח. צג באמצעות סטריאומיקרוסקופ סטנדרטי.
- תולעי גלולה על ידי צנטריפוגה ב 900 x g במשך 1 דקות. הסר את העל-טבעי.
- לשטוף את גלולת התולעת 3 פעמים על ידי הוספת 800 μL של חיץ M9 וצנטריפוגה ב 900 x g.
- מניחים את הביצים המנקות על לוחות NGM טריים עם חיידקי OP50. לגדל אוכלוסייה מולבן על חיידקים OP50 ב 15 מעלות צלזיוס עד שהם מגיעים שלב L4 (כ 4 ימים). זחלי L4 יכולים להיות מזוהים על ידי כתם לבן בערך באמצע הדרך לאורך הצד הגחוני של התולעת באמצעות סטריאומיקרוסקופ סטנדרטי.
שים לב: כדי להשיג את תא הנבט פנוטיפ המרת נוירון על דלדול של לין-53, זה צריך להיות מדולדל בדור ההורים (P0). הניקוד עבור פנוטיפ ההמרה מתבצע בדור הבא (דור filial F1). כדי להשיג את לין-53 דלדול כבר P0, L4 בעלי חיים כפופים RNAi.
- העברה ידנית של 50 תולעי שלב L4 לכל שכפול באמצעות חוט פלטינה ללוחית NGM שאינה מכילה חיידקים כלשהם ונותן לתולעים להתרחק מכל חיידקי OP50 שהועברו. תן לתולעים לנוע על הצלחת במשך כ -5 דקות. השתמש בחיידקים מלוחות RNAi NGM-אגר שנזרעו בעבר עם חיידקי לין-53 RNAi (או בקרה וקטורית ריקה) כדי לעבור ללוחות RNAi המתאימים.
- הימנע מהעברת חיידקי OP50 ללוחות RNAi בפועל. לעבוד מהר כדי למזער את זמן החשיפה של המתח לטמפרטורות גבוהות מ 15 °C (60 °F).
- דגירה תולעים על לוחות NGM-אגר RNAi ב 15 °C (7 °F) במשך כ 7 ימים עד צאצאי F1 של התולעים מגיע L3 – שלב L4. הם יכולים להיות מופרדים בבירור מבעלי החיים P0 שכן הם גדולים ועבים יותר מאשר צאצאי F1.
- בדקו באופן ויזואלי תחת סטריאומיקרוסקופ סטנדרטי אם תולעים צאצאיות F1 מציגות את פנוטיפ הפות הבולט (pvul) כפי שמוצג באיור 1. RNAi נגד לין-53 יש השפעות pleiotropic וגורם פנוטיפ pvul אשר ניתן להשתמש בהם כדי להעריך אם RNAi נגד לין-53 הצליח.
שים לב: RNAi נגד לין-53 יכול גם לגרום קטלניות של עוברי F1. אפקט זה גדל אם לוחות נחשפים במעלות גבוהות יותר מ 15 °C (60 °F) לפני בעלי חיים הגיעו לשלב L3 – L4. עוברים מתים יכולים להיות מוכרים על ידי התפתחות שנעצרה וחוסר הבקיעה. - צלחות דגירה בחושך מאז IPTG הוא רגיש לאור.
- בדקו באופן ויזואלי תחת סטריאומיקרוסקופ סטנדרטי אם תולעים צאצאיות F1 מציגות את פנוטיפ הפות הבולט (pvul) כפי שמוצג באיור 1. RNAi נגד לין-53 יש השפעות pleiotropic וגורם פנוטיפ pvul אשר ניתן להשתמש בהם כדי להעריך אם RNAi נגד לין-53 הצליח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1: פנוטיפ Pvul שנגרם על-ידי RNAi נגד lin-53. (למעלה) אני לא יכול לעשות את זה. תמונת DIC של תולעי F1 בשלב F1 למבוגרים צעירים שמקורן בשליטה או לין-53 RNAi שטופלו באימהות. סרגלי קנה מידה = 20 מיקרומטר. (תחתון) בעלי חיים שטופלו עם לין-53 RNAi להציג את הפות הבולט (pvul) פנוטיפ (ראשי חץ שחורים). פנוטיפ pvul מאשר כי RNAi נגד לין-53 היה מוצלח. סרגלי קנה מידה = 20 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals | |||
Agar-Agar, Kobe I | Roth | 5210.1 | |
Bactopeptone | A. Hartenstein GmbH | 211 677 | Peptone Media |
Yeast extract | AppliChem | A1552,0100 | |
Amphotericin B | USBiological | A2220 | |
CaCl2 | Merck Biosciences | 208290 | |
Cholesterol | Roth | 8866.2 | |
Gelatine | Roth | 4275.3 | |
IPTG | Sigma | 15502-10G | |
K2PO4 | Roth | T875.2 | |
KH2PO4 | Roth | 3904.2 | |
MgSO4 | VWR | 25,163,364 | |
Na2HPO4 | Roth | P030.1 | |
NaCl | Roth | 9265.1 | |
NaClO | Roth | 9062.3 | |
NaOH (5 N) | Roth | KK71.1 | |
Tris | Roth | AE15.2 | |
Carbenicillin | Roth | 634412 | |
Tetracycline | Roth | 2371.2 | |
Incubators | |||
Incubator | Sanyo MIR-5 | 5534210 | for maintenance of worm strains at 15 °C or 25 °C |
Microscopes | |||
Stereomicroscope | SMZ745 | Nikon | |
Bacterial strains | |||
Escherichia coli HT115 | F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5promoter -T7 polymerase) (IPTG-inducible T7 polymerase) (RNAseIII minus). | ||
Escherichia coli OP50 | Uracil auxotroph E. coli strain | ||
Worm strains | |||
BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1::3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V. | derived from OH9846 by 4x times more back crossing with N2 | ||
RNAi Clones | |||
lin-53 | SourceBioscience | ID I-4D14 | Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12 |
empty vetor: L4440 | Addgene | #1654 |