RNAi-plätering för C. elegansmatning: En teknik för att inducera mål dsRNA-uttryck i E. coli

Overview

Denna video beskriver principerna bakom RNAi behandling i C. elegans och visar ett protokoll till knockdown lin-35 i en transgen mask stam.

Protocol

Detta protokoll är utdraget från Kolundzic, et al, Tillämpning av RNAi och Värmechock-inducerad transkription faktor uttryck för att omprogrammera könsceller till nervceller i C. elegans, J. Vis. Exp. (2018).

1. Lösningsberedning
   1. NGM-Agar plattor (1 L)
      1. Tillsätt 3 g NaCl, 2,5 g peptone media (t.ex. Bacto-Peptone) och 20 g agar. Efter autoklavering, tillsätt 1 ml kolesterol (5 mg/ml i 95% EtOH-lager), 1 ml 1 M MgSO_4,1 ml 1 M CaCl2, 25 ml 1 M K2PO₄och 1 ml amphotericin B (2,5 mg/ml lager).
   2. NGM-Agar RNAi plattor (1 L)
      1. Tillsätt 3 g NaCl, 2,5 g peptone media och 20 g agar. Efter autoklavering tillsätt, 1 ml kolesterol (5 mg/ml i 95% EtOH lager), 1 ml 1 M MgSO_4,1 ml 1 M CaCl2, 25 ml 1 M K₂PO_4,1 ml amphotericin B (2,5 mg/ml lager), 1 ml 1 M IPTG och 1 ml karbinicillin (50 mg/ml).
   3. LB-Agar (1 L)
      1. Tillsätt 10 g peptone media, 5 g jästextrakt, 5 g NaCl, 20 g agar, 10 ml 1 M Tris pH 8,0. Tillsätt H₂O till 1 L. Efter autoklavering, tillsätt 1 ml 50 mg/mL kardenicillin och 2,5 ml 5 mg/mL tetracyklin.
   4. LB Medium (1 L)
      1. Tillsätt 10 g peptone media, 5 g jästextrakt, 5 g NaCl och 10 ml 1 M Tris pH 8,0. Tillsätt H₂O till 1 L. Efter autoklavering, tillsätt 1 ml 50 mg/mL kardenicillin.
   5. M9-buffert (1 L)
      1. Tillsätt 6,0 g Na₂HPO_4,3 g KH₂PO_4,5 g NaCl och 50 mg gelatin. Före användning, tillsätt 1 ml 1 M MgSO₄.
   6. Blekningslösning (10 ml)
      1. Tillsätt 1 ml NaClO och 2 ml 5 N NaOH. Tillsätt H2O till 10 ml.
2. Beredning av RNAi-plattor
   OBS: C. elegans odlas vanligtvis i laboratoriet på 6 cm Petriplattor som innehåller 7,5 ml Nematod Growth Medium Agar (NGM-Agar). Detta protokoll är optimerat för maskar som hålls vid 15 °C. För att förbereda plattor med NGM, använd standard sterila tekniker för att förhindra svamp och bakteriell förorening. Följande är protokollet för att förbereda NGM-plattor kompletterade med reagenser för RNAi.
   1. Förbered 6-cm NGM-Agar RNAi-plattor som innehåller 1 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) och 50 μg/mL karbenicillin. Låt dem torka i 24 - 48 timmar vid rumstemperatur i mörkret¹².
      1. Håll RNAi-plattorna på 4 °C i mörker. Använd inte om du är äldre än 14 dagar.
   2. Välj RNAi-bakterierna (Escherichia coli HT115) klon som innehåller L4440-plasmiden med lin-53 gen-DNA-sekvensen från det frysta glycerolbeståndet från det tillgängliga RNAi-biblioteket på LB-agarplattor som innehåller 50 μg/mL-karbidylillin och 12,5 μg/mL tetracyklin med hjälp av trefasstreckmönstret. Odla bakterierna vid 37 °C över natten. Denna klon tillåter IPTG-beroende produktion av lin-53 dsRNA i bakterierna.
      1. Dessutom växa RNAi bakterier som innehåller L4440 plasmid utan någon gensekvens som den tomma vektorkontrollen.
   3. Nästa dag, välj en enda koloni från lin-53 eller tom vektor LB-agar plattor med en 200 μL pipettspets och inokulera var och en av dem i ett separat odlingsrör som innehåller 2 ml flytande LB medium kompletterat med 50 μg / mL karbinicillin. Odla kulturer över natten vid 37 °C tills de når en optisk densitet (OD) vid 600 nm på 0,6 – 0,8. Mät OD med en spektrofotometer.
      VARNING: Det flytande LB-mediet bör inte innehålla tetracyklin i motsats till LB-agar-plattan som används för att strecka bakterierna från glycerolbeståndet, eftersom införandet av tetracyklin under utfodring leder till en minskad RNAi-effektivitet.
   4. Tillsätt 500 μL av varje bakteriekultur(lin-53 eller tom vektor) till 6 cm NGM-Agar RNAi-plattor med en multipipett. Inkubera tallrikar med ett stängt lock över natten vid rumstemperatur i mörkret för att torka. Under denna tid kommer IPTG i NGM-plattorna att inducera produktion av dsRNA i bakterierna.
      1. Använd minst 3 plattor per bakteriekultur per experiment. Detta kommer att ge 3 tekniska replikat för varje experiment.
   • Förvara torkade NGM-agar RNAi-plattor med bakterier vid 4 °C i mörker i upp till två veckor.
3. Förberedelse av C. elegans Stam BAT28
4. Behåll maskstammen BAT28 som innehåller transgenerna otIs305 [hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)] och ntIs1 [gcy-5prom::gfp] på OP50-bakterier med vanliga NGM-Agar-plattor vid 15 °C.
   OBS: För detaljerade protokoll om Nematode kultur, se. Rol-6(su1006) är en dominerande allel och vanligen används fenotypisk injektion markör¹⁶ som orsakar den typiska rullande rörelsen. Det används i otIs305 transgene för att spåra hsp-16.2prom::che-1.
   1. Håll BAT28-stammen vid 15 °C hela tiden för att förhindra precautious aktivering av hsp-16.2prom::che-1 transgen. Minska exponeringen för temperaturer över 15 °C när du hanterar belastningen så mycket som möjligt.
5. Om du vill ålderssynkron synkronisera maskar använder du blekningstekniken.
   1. Tvätta av 6 cm NGM-Agar-plattor som innehåller vuxna och ägg av BAT28 med 900 μL M9-buffert. Pelletsmaskar genom centrifugering vid 900 x g i 1 min. Ta bort supernaten.
   2. Tillsätt 0,5 – 1 ml blekningslösning och skaka röret i ca 1 min tills vuxna maskar börjar brista upp. Bildskärm med ett vanligt stereomikroskop.
   3. Pelletsmaskar genom centrifugering vid 900 x g i 1 min. Ta bort supernaten.
   4. Tvätta maskpelleten 3 gånger genom att tillsätta 800 μL M9-buffert och centrifugering vid 900 x g.
   5. Placera de rengjorda äggen på färska NGM-tallrikar sådda med OP50-bakterier. Odla en blekt population på OP50-bakterier vid 15 °C tills de når L4-stadiet (cirka 4 dagar). L4 larver kan kännas igen av en vit fläck ungefär halvvägs längs maskens ventrala sida med hjälp av ett standard stereomikroskop.
      OBS: För att uppnå bakteriecellen till neuron omvandling fenotyp vid utarmning av lin-53, det måste tömmas i föräldragenerationen (P0). Poängen för konverterings fenotyp utförs i följande generation (filial generation F1). För att uppnå den utarmade lin-53 redan i P0 utsätts L4-djur för RNAi.
6. Överför manuellt 50 L4-scenmaskar per replikat med en platinatråd till en NGM-platta som inte innehåller några bakterier och låter maskar röra sig bort från eventuella överförda OP50-bakterier. Låt maskar röra sig på tallriken i cirka 5 minuter. Använd bakterier från NGM-Agar RNAi-plattorna som tidigare såts med lin-53 RNAi-bakterier (eller tom vektorkontroll) för att överföra till respektive RNAi-plattor.
   1. Undvik att överföra OP50-bakterier till de faktiska RNAi-plattorna. Arbeta snabbt för att minimera exponeringstiden för belastningen till temperaturer över 15 °C.
7. Inkubera maskar på NGM-Agar RNAi-plattor vid 15 °C i cirka 7 dagar tills F1-avkomman av maskarna når L3 - L4-stadiet. De kan tydligt separeras från P0-djuren eftersom de är större och tjockare än F1-avkomman.
   1. Kontrollera visuellt under ett standardstereomikroskop om F1-avkommamaskar visar den utskjutande feotypenvulva (pvul)enligt figur 1. RNAi mot lin-53 har pleiotropa effekter och orsakar pvul fenotyp som kan användas för att bedöma om RNAi mot lin-53 har varit framgångsrik.
      OBS:  RNAi mot lin-53 kan också orsaka dödlighet av F1-embryon. Denna effekt ökar om plattor utsätts för högre grader än 15 °C innan djuren når L3 - L4-stadiet. Döda embryon kan kännas igen av arresterad utveckling och brist på kläckning.
   2. Inkubera plattor i mörkret eftersom IPTG är ljuskänsligt.

Representative Results

Figur 1: Pvul fenotyp orsakad av RNAi mot lin-53. - Jag har inte tid med det här. DIC bild av L4/ung vuxen steg F1 avkomma maskar härrör från kontroll eller lin-53 RNAi behandlade mödrar. Skalstänger = 20 μm. (Botten) Djur behandlade med lin-53 RNAi visar den utskjutande vulva(pvul)fenotyp (svarta pilhuvuden). Pvul fenotyp bekräftar att RNAi mot lin-53 lyckades. Skalstänger = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Agar-Agar, Kobe I	Roth	5210.1
Bactopeptone	A. Hartenstein GmbH	211 677	Peptone Media
Yeast extract	AppliChem	A1552,0100
Amphotericin B	USBiological	A2220
CaCl2	Merck Biosciences	208290
Cholesterol	Roth	8866.2
Gelatine	Roth	4275.3
IPTG	Sigma	15502-10G
K2PO4	Roth	T875.2
KH2PO4	Roth	3904.2
MgSO4	VWR	25,163,364
Na2HPO4	Roth	P030.1
NaCl	Roth	9265.1
NaClO	Roth	9062.3
NaOH (5 N)	Roth	KK71.1
Tris	Roth	AE15.2
Carbenicillin	Roth	634412
Tetracycline	Roth	2371.2
Incubators
Incubator	Sanyo MIR-5	5534210	for maintenance of worm strains at 15 °C or 25 °C
Microscopes
Stereomicroscope	SMZ745	Nikon
Bacterial strains
Escherichia coli HT115			F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5promoter -T7 polymerase) (IPTG-inducible T7 polymerase) (RNAseIII minus).
Escherichia coli OP50			Uracil auxotroph E. coli strain
Worm strains
BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1::3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.			derived from OH9846 by 4x times more back crossing with N2
RNAi Clones
lin-53	SourceBioscience	ID I-4D14	Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12
empty vetor: L4440	Addgene	#1654