Detta protokoll är utdraget från Kolundzic, et al, Tillämpning av RNAi och Värmechock-inducerad transkription faktor uttryck för att omprogrammera könsceller till nervceller i C. elegans, J. Vis. Exp. (2018).
- Lösningsberedning
-
NGM-Agar plattor (1 L)
- Tillsätt 3 g NaCl, 2,5 g peptone media (t.ex. Bacto-Peptone) och 20 g agar. Efter autoklavering, tillsätt 1 ml kolesterol (5 mg/ml i 95% EtOH-lager), 1 ml 1 M MgSO4,1 ml 1 M CaCl2, 25 ml 1 M K2PO4och 1 ml amphotericin B (2,5 mg/ml lager).
-
NGM-Agar RNAi plattor (1 L)
- Tillsätt 3 g NaCl, 2,5 g peptone media och 20 g agar. Efter autoklavering tillsätt, 1 ml kolesterol (5 mg/ml i 95% EtOH lager), 1 ml 1 M MgSO4,1 ml 1 M CaCl2, 25 ml 1 M K2PO4,1 ml amphotericin B (2,5 mg/ml lager), 1 ml 1 M IPTG och 1 ml karbinicillin (50 mg/ml).
-
LB-Agar (1 L)
- Tillsätt 10 g peptone media, 5 g jästextrakt, 5 g NaCl, 20 g agar, 10 ml 1 M Tris pH 8,0. Tillsätt H2O till 1 L. Efter autoklavering, tillsätt 1 ml 50 mg/mL kardenicillin och 2,5 ml 5 mg/mL tetracyklin.
-
LB Medium (1 L)
- Tillsätt 10 g peptone media, 5 g jästextrakt, 5 g NaCl och 10 ml 1 M Tris pH 8,0. Tillsätt H2O till 1 L. Efter autoklavering, tillsätt 1 ml 50 mg/mL kardenicillin.
-
M9-buffert (1 L)
- Tillsätt 6,0 g Na2HPO4,3 g KH2PO4,5 g NaCl och 50 mg gelatin. Före användning, tillsätt 1 ml 1 M MgSO4.
-
Blekningslösning (10 ml)
- Tillsätt 1 ml NaClO och 2 ml 5 N NaOH. Tillsätt H2O till 10 ml.
- Beredning av RNAi-plattor
OBS: C. elegans odlas vanligtvis i laboratoriet på 6 cm Petriplattor som innehåller 7,5 ml Nematod Growth Medium Agar (NGM-Agar). Detta protokoll är optimerat för maskar som hålls vid 15 °C. För att förbereda plattor med NGM, använd standard sterila tekniker för att förhindra svamp och bakteriell förorening. Följande är protokollet för att förbereda NGM-plattor kompletterade med reagenser för RNAi.
-
Förbered 6-cm NGM-Agar RNAi-plattor som innehåller 1 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) och 50 μg/mL karbenicillin. Låt dem torka i 24 - 48 timmar vid rumstemperatur i mörkret12.
- Håll RNAi-plattorna på 4 °C i mörker. Använd inte om du är äldre än 14 dagar.
-
Välj RNAi-bakterierna (Escherichia coli HT115) klon som innehåller L4440-plasmiden med lin-53 gen-DNA-sekvensen från det frysta glycerolbeståndet från det tillgängliga RNAi-biblioteket på LB-agarplattor som innehåller 50 μg/mL-karbidylillin och 12,5 μg/mL tetracyklin med hjälp av trefasstreckmönstret. Odla bakterierna vid 37 °C över natten. Denna klon tillåter IPTG-beroende produktion av lin-53 dsRNA i bakterierna.
- Dessutom växa RNAi bakterier som innehåller L4440 plasmid utan någon gensekvens som den tomma vektorkontrollen.
- Nästa dag, välj en enda koloni från lin-53 eller tom vektor LB-agar plattor med en 200 μL pipettspets och inokulera var och en av dem i ett separat odlingsrör som innehåller 2 ml flytande LB medium kompletterat med 50 μg / mL karbinicillin. Odla kulturer över natten vid 37 °C tills de når en optisk densitet (OD) vid 600 nm på 0,6 – 0,8. Mät OD med en spektrofotometer.
VARNING: Det flytande LB-mediet bör inte innehålla tetracyklin i motsats till LB-agar-plattan som används för att strecka bakterierna från glycerolbeståndet, eftersom införandet av tetracyklin under utfodring leder till en minskad RNAi-effektivitet.
-
Tillsätt 500 μL av varje bakteriekultur(lin-53 eller tom vektor) till 6 cm NGM-Agar RNAi-plattor med en multipipett. Inkubera tallrikar med ett stängt lock över natten vid rumstemperatur i mörkret för att torka. Under denna tid kommer IPTG i NGM-plattorna att inducera produktion av dsRNA i bakterierna.
- Använd minst 3 plattor per bakteriekultur per experiment. Detta kommer att ge 3 tekniska replikat för varje experiment.
- Förvara torkade NGM-agar RNAi-plattor med bakterier vid 4 °C i mörker i upp till två veckor.
- Förberedelse av C. elegans Stam BAT28
- Behåll maskstammen BAT28 som innehåller transgenerna otIs305 [hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)] och ntIs1 [gcy-5prom::gfp] på OP50-bakterier med vanliga NGM-Agar-plattor vid 15 °C.
OBS: För detaljerade protokoll om Nematode kultur, se. Rol-6(su1006) är en dominerande allel och vanligen används fenotypisk injektion markör16 som orsakar den typiska rullande rörelsen. Det används i otIs305 transgene för att spåra hsp-16.2prom::che-1.
- Håll BAT28-stammen vid 15 °C hela tiden för att förhindra precautious aktivering av hsp-16.2prom::che-1 transgen. Minska exponeringen för temperaturer över 15 °C när du hanterar belastningen så mycket som möjligt.
- Om du vill ålderssynkron synkronisera maskar använder du blekningstekniken.
- Tvätta av 6 cm NGM-Agar-plattor som innehåller vuxna och ägg av BAT28 med 900 μL M9-buffert. Pelletsmaskar genom centrifugering vid 900 x g i 1 min. Ta bort supernaten.
- Tillsätt 0,5 – 1 ml blekningslösning och skaka röret i ca 1 min tills vuxna maskar börjar brista upp. Bildskärm med ett vanligt stereomikroskop.
- Pelletsmaskar genom centrifugering vid 900 x g i 1 min. Ta bort supernaten.
- Tvätta maskpelleten 3 gånger genom att tillsätta 800 μL M9-buffert och centrifugering vid 900 x g.
- Placera de rengjorda äggen på färska NGM-tallrikar sådda med OP50-bakterier. Odla en blekt population på OP50-bakterier vid 15 °C tills de når L4-stadiet (cirka 4 dagar). L4 larver kan kännas igen av en vit fläck ungefär halvvägs längs maskens ventrala sida med hjälp av ett standard stereomikroskop.
OBS: För att uppnå bakteriecellen till neuron omvandling fenotyp vid utarmning av lin-53, det måste tömmas i föräldragenerationen (P0). Poängen för konverterings fenotyp utförs i följande generation (filial generation F1). För att uppnå den utarmade lin-53 redan i P0 utsätts L4-djur för RNAi.
- Överför manuellt 50 L4-scenmaskar per replikat med en platinatråd till en NGM-platta som inte innehåller några bakterier och låter maskar röra sig bort från eventuella överförda OP50-bakterier. Låt maskar röra sig på tallriken i cirka 5 minuter. Använd bakterier från NGM-Agar RNAi-plattorna som tidigare såts med lin-53 RNAi-bakterier (eller tom vektorkontroll) för att överföra till respektive RNAi-plattor.
- Undvik att överföra OP50-bakterier till de faktiska RNAi-plattorna. Arbeta snabbt för att minimera exponeringstiden för belastningen till temperaturer över 15 °C.
- Inkubera maskar på NGM-Agar RNAi-plattor vid 15 °C i cirka 7 dagar tills F1-avkomman av maskarna når L3 - L4-stadiet. De kan tydligt separeras från P0-djuren eftersom de är större och tjockare än F1-avkomman.
- Kontrollera visuellt under ett standardstereomikroskop om F1-avkommamaskar visar den utskjutande feotypenvulva (pvul)enligt figur 1. RNAi mot lin-53 har pleiotropa effekter och orsakar pvul fenotyp som kan användas för att bedöma om RNAi mot lin-53 har varit framgångsrik.
OBS: RNAi mot lin-53 kan också orsaka dödlighet av F1-embryon. Denna effekt ökar om plattor utsätts för högre grader än 15 °C innan djuren når L3 - L4-stadiet. Döda embryon kan kännas igen av arresterad utveckling och brist på kläckning.
- Inkubera plattor i mörkret eftersom IPTG är ljuskänsligt.
