C. elegans Besleme için RNAi Kaplama: E. coli'de Hedef dsRNA İfadesini Teşvik Etmek İçin Bir Teknik

Overview

Bu video, C. elegans'ta RNAi tedavisinin arkasındaki ilkeleri açıklar ve transgenik bir solucan suşunda lin-35'i devirmek için bir protokol göstermektedir.

Protocol

Bu protokol Kolundzic, ve diğerleri,RNAi uygulaması ve ısı şoku kaynaklı Transkripsiyon Faktörü İfadesi'nden alıntılanmıştır Germ Hücrelerini C. elegans, J. Vis.Exp'teki Nöronlara Yeniden Programlamakiçin.  (2018). 

1. Çözüm Hazırlama
   1. NGM-Agar plakaları (1 L)
      1. 3 g NaCl, 2,5 g pepton ortamı (örneğin, Bacto-Peptone) ve 20 g agar ekleyin. Otoklavlamadan sonra, 1 mL kolesterol (%95 EtOH stoğunda 5 mg/mL), 1 mL 1 M MgSO_4,1 mL 1 M CaCl2, 25 mL 1 M K2PO₄ve 1 mL amfoterisikin B (2,5 mg/mL stok) ekleyin.
   2. NGM-Agar RNAi plakaları (1 L)
      1. 3 g NaCl, 2,5 g pepton ortamı ve 20 g agar ekleyin. Otoklavlamadan sonra, 1 mL kolesterol (% 95 EtOH stoğunda 5 mg / mL), 1 mL 1 M MgSO_4,1 mL 1 M CaCl2, 25 mL 1 M K₂PO_4,1 mL amfoterisilin B (2,5 mg/mL stok), 1 mL 1 M IPTG ve 1 mL karbenisilin (50 mg/mL).
   3. LB-Agar (1 L)
      1. 10 g pepton ortamı, 5 g maya özü, 5 g NaCl, 20 g agar, 10 mL 1 M Tris pH 8.0 ekleyin. 1 L'ye H₂O ekleyin. Otoklavlamadan sonra 1 mL 50 mg/mL karbenisilin ve 2,5 mL 5 mg/mL tetrasiklin ekleyin.
   4. LB Orta (1 L)
      1. 10 g pepton ortamı, 5 g maya özü, 5 g NaCl ve 10 mL 1 M Tris pH 8.0 ekleyin. 1 L'ye H₂O ekleyin. Otoklavlamadan sonra, 1 mL 50 mg / mL karbenisilin ekleyin.
   5. M9 arabelleği (1 L)
      1. 6.0 g Na₂HPO₄, 3 g KH₂PO_4,5 g NaCl ve 50 mg jelatin ekleyin. Kullanmadan önce, 1 mL 1 M MgSO₄ekleyin.
   6. Ağartma çözeltisi (10 mL)
      1. 1 mL NaClO ve 2 mL 5 N NaOH ekleyin. H2O'yu 10 mL'ye ekleyin.
2. RNAi Plakalarının Hazırlanması
   NOT: C. elegans tipik olarak laboratuvarda 7,5 mL Nematod Growth Medium Agar (NGM-Agar) içeren 6 cm Petri plakaları üzerinde kültüre edilir. Bu protokol 15 °C'de tutulan solucanlar için optimize edilmiştir. NGM ile plaka hazırlamak için mantar ve bakteriyel kirlenmeyi önlemek için standart steril teknikleri kullanın. Aşağıda, RNAi için reaktiflerle desteklenmiş NGM plakaları hazırlama protokolü yer alıyor.
   1. 1 mM İzopropil β-D-1-tiyogalactopyranoside (IPTG) ve 50 μg/mL karbenisilin içeren 6 cm NGM-Agar RNAi plakaları hazırlayın. Karanlıkta oda sıcaklığında 24 – 48 saat kurumasına izin verin¹².
      1. RNAi plakalarını karanlıkta 4 °C'de tutun. 14 günden büyükse kullanmayın.
   2. Mevcut R'den dondurulmuş gliserol stoğundan lin-53 gen DNA dizisi ile L4440 plazmidini içeren RNAi bakterisini (Escherichia coli HT115) klonunu seçin Üç fazlı çizgi deseni kullanılarak 50 μg/mL karbenisilin ve 12,5 μg/mL tetrasiklin içeren LB-agar plakalar üzerindeNAi kütüphanesi. Bakterileri bir gecede 37 °C'de yetiştirin. Bu klon, bakterilerde lin-53 dsRNA'nın IPTG'ye bağımlı üretimine izin verir.
      1. Ek olarak, boş vektör kontrolü olarak herhangi bir gen dizisi olmadan L4440 plazmidini içeren RNAi bakterileri yetiştirin.
   3. Ertesi gün, 200 μL pipet ucu kullanarak lin-53 veya boş vektör LB-agar plakalarından tek bir koloni seçin ve her birini 50 μg / mL karbenisilin ile desteklenmiş 2 mL sıvı LB ortamı içeren ayrı bir kültür tüpüne aşılayın. Kültürleri 0,6 – 0,8'in 600 nm'sinde optik yoğunluğa (OD) ulaşana kadar 37 °C'de bir gecede büyütün. Spektrofotometre kullanarak OD'i ölçün.
      DİkKAT: Sıvı LB ortamı, gliserol stoğundaki bakterileri çizgilendirmek için kullanılan LB-agar plakasının aksine tetrasiklin içermemelidir, çünkü besleme sırasında tetrasiklin dahil edilmesi RNAi verimliliğinin azalmasına yol açar.
   4. Bir multipipette kullanarak 6 cm NGM-Agar RNAi plakalarına her bakteri kültürünün 500 μL'sini(lin-53 veya boş vektör) ekleyin. Kurumak için karanlıkta oda sıcaklığında gece boyunca kapalı kapaklı tabakları kuluçkaya bırakın. Bu süre zarfında, NGM plakalarındaki IPTG bakterilerde dsRNA üretimine neden olacaktır.
      1. Deney başına bakteri kültürü başına en az 3 tabak kullanın. Bu, her deneme için 3 teknik çoğaltma sağlayacaktır.
   • Kurutulmuş NGM-agar RNAi plakalarını karanlıkta 4 °C'de bakterilerle iki haftaya kadar saklayın.
3. C. elegans Strain BAT28'in hazırlanması
4. 15 °C'de standart NGM-Agar plakalarını kullanarak OP50 bakterilerinde otIs305 [hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)] ve ntIs1 [gcy-5prom::gfp] transgenes otIs305 içeren bat28 solucan suşunu koruyun.
   NOT: Nematod kültürü hakkında ayrıntılı protokol için bkz. Rol-6(su1006) baskın bir aleledir ve tipik yuvarlanma hareketine neden olan yaygın olarak kullanılan fenotipik enjeksiyon işareti^16'dır. Hsp-16.2prom::che-1izlemek için otIs305 transgene kullanılır.
   1. Hsp-16.2prom::che-1 transgene'in önceden aktivasyonunu önlemek için BAT28 suşunu her zaman 15 °C'de tutun. Suşu mümkün olduğunca tutarken 15 °C'den yüksek sıcaklıklara maruz kalmayı azaltın.
5. Solucanları yaş senkronize etmek için ağartma tekniğini kullanın.
   1. 900 μL M9 tampon kullanarak BAT28 yetişkin ve yumurta içeren 6 cm NGM-Agar plakalarını yıkayın. 1 dakika boyunca 900 x g'da santrifüjleme yaparak pelet solucanları. Üsttekini çıkarın.
   2. 0,5 – 1 mL ağartma çözeltisi ekleyin ve yetişkin solucanlar açılmaya başlayana kadar tüpü yaklaşık 1 dakika sallayın. Standart stereomikroskop kullanarak izleyin.
   3. 1 dakika boyunca 900 x g'da santrifüjleme yaparak pelet solucanları. Üsttekini çıkarın.
   4. Solucan peletini 800 μL M9 tamponu ekleyerek ve 900 x g'da santrifüjleme yaparak 3 kez yıkayın.
   5. Temizlenmiş yumurtaları OP50 bakterisi ile tohumlanmış taze NGM plakalarının üzerine yerleştirin. L4 aşamasına (yaklaşık 4 gün) ulaşana kadar OP50 bakterilerinde 15 °C'de ağartılmış bir popülasyon yetiştirin. L4 larvaları, standart bir stereomikroskop kullanılarak solucanın ventral tarafı boyunca yaklaşık yarı yolda beyaz bir yama ile tanınabilir.
      NOT: Mikrop hücresini lin-53'üntükenmesi üzerine nöron dönüşüm fenotipine ulaşmak için ebeveyn neslinde (P0) tükenmesi gerekir. Dönüşüm fenotipi için puanlama aşağıdaki nesilde (filial nesil F1) yapılır. Zaten P0'da bulunan tükenmiş lin-53'ü elde etmek için L4 hayvanları RNAi'ye tabi tutulur.
6. Bir platin tel kullanarak çoğaltma başına 50 L4 aşama solucanını herhangi bir bakteri içermeyen bir NGM plakasına manuel olarak aktarın ve solucanların aktarılan OP50 bakterilerinden uzaklaşmasına izin verin. Solucanların yaklaşık 5 dakika boyunca plaka üzerinde hareket etmesine izin verin. İlgili RNAi plakalarına aktarmak için daha önce lin-53 RNAi bakterisi (veya boş vektör kontrolü) ile tohumlanmış NGM-Agar RNAi plakalarından bakteriler kullanın.
   1. OP50 bakterilerini gerçek RNAi plakalarına aktarmaktan kaçının. Suşun 15 °C'den yüksek sıcaklıklara maruz kalma süresini en aza indirmek için hızlı çalışın.
7. Solucanların F1 soyu L3 - L4 aşamasına ulaşana kadar yaklaşık 7 gün boyunca NGM-Agar RNAi plakalarında solucanları 15 °C'de kuluçkaya yatırın. F1 soyundan daha büyük ve kalın oldukları için P0 hayvanlarından açıkça ayrılabilirler.
   1. F1 soy solucanlarının Şekil1'de gösterildiği gibi çıkıntılı vulva (pvul) fenotipini gösterip göstermediğini standart bir stereomikroskop altında görsel olarak kontrol edin. Lin-53'e karşı RNAi pleiotropik etkilere sahiptir ve lin-53'e karşı RNAi'nin başarılı olup olmadığını değerlendirmek için kullanılabilecek pvul fenotipine neden olur.
      NOT:  Lin-53'e karşı RNAi, F1 embriyolarının ölümcüllüğüne de neden olabilir. Bu etki, hayvanlar L3 - L4 aşamasına ulaşmadan önce plakalar 15 ° C'den daha yüksek derecelere maruz kalırsa artar. Ölü embriyolar, tutuklanmış gelişim ve kuluçka eksikliği ile tanınabilir.
   2. IPTG ışığa duyarlı olduğu için plakaları karanlıkta kuluçkaya yatırın.

Representative Results

Şekil 1: RNAi'nin lin-53'e karşı neden olduğu pvul fenotip. (Üstte) Kontrol veya lin-53 RNAi tedavi annelerinden elde edilen L4 /genç yetişkin evre F1 soy solucanlarının DIC resmi. Ölçek çubukları = 20 μm. (Alt) Lin-53 RNAi ile tedavi edilen hayvanlar çıkıntılı vulva (pvul) fenotipini (siyah ok kafaları) gösterir. Pvul fenotipi, lin-53'e karşı RNAi'nin başarılı olduğunu doğrular. Ölçek çubukları = 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Agar-Agar, Kobe I	Roth	5210.1
Bactopeptone	A. Hartenstein GmbH	211 677	Peptone Media
Yeast extract	AppliChem	A1552,0100
Amphotericin B	USBiological	A2220
CaCl2	Merck Biosciences	208290
Cholesterol	Roth	8866.2
Gelatine	Roth	4275.3
IPTG	Sigma	15502-10G
K2PO4	Roth	T875.2
KH2PO4	Roth	3904.2
MgSO4	VWR	25,163,364
Na2HPO4	Roth	P030.1
NaCl	Roth	9265.1
NaClO	Roth	9062.3
NaOH (5 N)	Roth	KK71.1
Tris	Roth	AE15.2
Carbenicillin	Roth	634412
Tetracycline	Roth	2371.2
Incubators
Incubator	Sanyo MIR-5	5534210	for maintenance of worm strains at 15 °C or 25 °C
Microscopes
Stereomicroscope	SMZ745	Nikon
Bacterial strains
Escherichia coli HT115			F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5promoter -T7 polymerase) (IPTG-inducible T7 polymerase) (RNAseIII minus).
Escherichia coli OP50			Uracil auxotroph E. coli strain
Worm strains
BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1::3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.			derived from OH9846 by 4x times more back crossing with N2
RNAi Clones
lin-53	SourceBioscience	ID I-4D14	Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12
empty vetor: L4440	Addgene	#1654