RNAi fodring i flydende kultur: En high-throughput metode til knockdown genekspression i C. elegans

Overview

RNAi er kraftfuld genetisk værktøj til rådighed for C. elegans forskere. Denne video introducerer en metode til behandling af flere orme med RNAi end plade fodring ved at udnytte flydende kultur betingelser.

Protocol

Denne protokol er et uddrag fra Groh et al, Metoder til at studere ændringer i iboende Protein Sammenlægning med alder i Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2017).

1. Flydende kultur af gonad-mindre dyr til at indsamle unge og ældre dyr, der udsættes for RNAi rettet mod et gen af interesse

BEMÆRK: Reaktionen fra nogle gener på RNAi kan være temperaturafhængig som tidligere beskrevet. Som et alternativ til RNAi, en mutant gen kunne indarbejdes i gon-2 (-) baggrund.

1. Forberedelse af bakterier til flydende kultur
   1. Forbered OP50- og RNAi-bakterier (bakterier, der producerer det ønskede dsRNA og bakterier med den tomme vektor som kontrol) ved at vaccinere 4 L LB-medium med 12 mL af den respektive bakteriekultur (tilsæt en endelig koncentration på 50 μg/mL carbenicillin og 1 mM IPTG til RNAi bakteriekulturerne) og inkuber dem ved 37 °C natten over ved 180 rpm.
   2. Den næste dag høstes kulturerne ved 6.700 x g i 10 minutter ved 4 °C. Supernatanterne fjernes, og hver pellet genbruges i 60 mL iskoldt S basalmedie (100 mM NaCl, 50 mM kaliumphosphat pH 6, opbevaret på is). Hold de tre genbrugte pellets (OP50, kontrol RNAi bakterier, og RNAi bakterier for genet af interesse) ved 4 °C indtil trin 1.2.
      BEMÆRK: Orme kan dyrkes på RNAi fra L1-trin eller for at undgå udviklingsdefekter fra sidste larvestadium L4 (se trin 1.2).
2. Flydende kultur til behandling med RNAi starter ved sidste larvestadium L4
   1. Der tilsættes 200 mL S basale medier i en Fernbach-kulturkolbe (kapacitet 2.800 mL). For et endeligt kulturvolumen på 300 mL (se 1.2.2.4), tilsættes 10 mM kaliumcitrat, pH 6, 3 mL Spormetalopløsning (5 mM ethylendiaminetetraeddikesyre (EDTA), 2,5 mM FeSO_4,1 mM MnCl₂, 1 mM ZnSO_{2 4}, 0,1 mM CuSO₄), 3 mM MgSO_4,3 mM CaCl_2,100 ng/mL carbendazim og 5 μg/mL kolesterol). Luk kolben med en membranskruehætte. Se tabel 1 for opskrifter på buffere.
   2. Tag L1'erne ud af 25 °C og overfør dem til 15 mL rør. Centrifuge ved 1.900 x g i 3 min. fjern supernatanten, og tæl L1'erne pr. 2 μL. Tilsæt 500.000 L1'er i Fernbach-dyrkningskolben, der blev tilberedt i det foregående trin.
   3. Tilføj OP50 (fra trin 1.1) proportionalt til antallet af orme. For 500.000 orme tilføjes f.eks.
   4. Komplet ormkultur med S basal for at bringe det samlede volumen til 300 mL. Ormkulturen inkuberes indtil L4-stadiet ved 25 °C i en rysteinkubator med 150 omdrejninger i minuttet.
   5. Den næste dag skal ormene være på størrelse med vilde L4'ere. At skifte fra OP50 til RNAi bakterier, indsamle dyr i seks 50 mL-rør, lad dem sediment og fjerne supernatant. L4'erne vaskes med M9 for at fjerne rest-OP50-bakterier: centrifuge ved 1900 x g i 3 minutter, supernatanten fjernes, og alle L4'er overføres til et 50 mL-rør. L4'erne tælles pr. 5 μL (mindst ni gange). To gange 50.000 L4'ere er nødvendige for den unge ormsamling, og der er brug for to gange 100.000 L4'ere til den gamle ormsamling.
   6. Fire Fernbach-kulturkolber fremstilles som beskrevet i 1.2.2.1. Der tilsættes også en endelig koncentration på 50 μg/mL Carbenicillin og 1 mM IPTG til hver kolbe.
   7. Tilføj kontrol RNAi bakterier og RNAi bakterier for genet af interesse (fra trin 1,1) proportionalt med antallet af orme: Tilføj 7 mL af de respektive bakterier pr kolbe for unge orme og 14 mL per kolbe for de gamle orme.
   8. Tilsæt 50.000 orme pr. kolbe til den unge ormsamling og 100.000 orme pr. kolbe til den gamle ormsamling, og afslut kulturerne med S basal for at fylde op til 300 mL. Ormens kulturer (fire i alt) inkuberes ved 25 °C og 150 omdrejninger i minuttet.

2. Vedligeholdelse af flydende C. elegans-kulturer

1. Med jævne mellemrum indsamle en aliquot fra hver flydende kultur og sted på et glas dias (alternativt på en agar plade) for at kontrollere, at der ikke er nogen forureninger. Ved hjælp af et dissektionsmikroskop skal du kontrollere de bakterielle fødevareniveauer i kulturen, især i vækstfasen. Forbered på forhånd 2 L kulturer kontrol RNAi bakterier og RNAi bakterier for genet af interesse som beskrevet i trin 1.1. Der tilsættes om nødvendigt disse til C. elegans flydende kulturer, og resten holdes ved 4 °C.
2. Kontroller regelmæssigt, at dyrene er sterile. De fleste dyr vil ikke have en gonad. Afhængigt af penetrance af gon-2 mutation, nogle kan have afbrudt gonadal strukturer, men ingen dyr med æg bør overholdes.

Lagerløsning	Beløb	Endelig koncentration	Bemærkninger/beskrivelse
S basal (For 500 mL: 5,9 g NaCl, 50 mL 1 M kaliumphosphat pH 6)	200 mL		1 M Kaliumphosphat pH 6: For 1 L: 129 g KH2PO4 monobasisk, 52 g K2HPO4 dibasisk vandfri
1 M Kaliumcitrat pH 6 (For 400 mL: 13,1 g citronsyremonohydrat 134,4 g tri-kaliumcitrat monohydrat)	3 mL	10 mM
Spormetalløsning (For 1 L: 1,86 g Ethylendiaminetetraeddikesyre (EDTA) 0,69 g FeSO4 · 7 H2O, 0,2 g MnCl2 · 4 H2O, 0,29 g ZnSO4 · 7 H2O, 0,025 g CuSO4 · 5 H2O)	3 mL		Opbevaringsopløsning i mørke ved 4 °C
1 M MgSO4 (For 500 mL: 123,3 g)	900 μL	3 mM
1 M CaCl2 (For 500 mL: 73,5 g)	900 μL	3 mM
200 μg/mL Carbendazim (For 50 mL: 10 mg i Methanol)	150 μL	100 ng/mL
5 mg/mL Kolesterol (For 100 mL: 0,5 g ethanol)	300 μL	5 μg/mL

Tabel 1.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fernbach culture flask	Corning	4425-2XL	Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents
Membrane Screw Cap	Schott	1E+06	GL45
Nutating Mixer	VWR	444-0148	yes
Separatory funnel	Nalgene	4300-1000	Capacity 1,000 ml
1 ml syringe	BD Plastipak	3E+05
Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm	BD Microlance 3	3E+05
Membrane filters 0.025 µM	Millipore	VSWP04700	no
pH strip	Machery-Nagel	92110	pH-Fix 0-14
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	5E+09	Complete Mini EDTA-free tablets
Octoxynol-9	Applichem	A1388	Triton X-100
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	M1317
Nonylphenylpolyethylenglycol	Applichem	A1694	Nonidet P40 (NP40)
DNaseI	Roche	5E+09	recombinant, RNase free
RNaseA	Promega	A7973	solution
Total protein blot staining	Thermofisher	S11791	Sypro Ruby protein blot stain
Total protein gel staining	Thermofisher	S12001	Sypro Ruby protein gel stain
TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride)	Serva	36970
Iodoacetamide	Serva	26710
Ammoniumbicarbonate	Sigma-Aldrich	9830
Sequencing Grade Modified Trypsin	Promega	V5111
Isobaric tags for relative and absolute quantitation	Sciex	4E+06	iTRAQ Reagents Multiplex Kit
Centrifuge Avanti J-26XP	Beckmann Coulter	4E+05
Ultracentrifuge Optima Max-XP	Beckmann Coulter	4E+05
Centrifuge 5424R	Eppendorf	5E+09
Centrifuge 5702	Eppendorf	6E+09
Centrifuge Megafuge 40R	Thermo Scientific	8E+07
Concentrator Plus	Eppendorf	5E+09	Centrifugal evaporator
Fluorescent stereo-microscope M165 FC	Leica		With Planapo 2.0x objective
Dissection microscope	Leica		Leica S6E
High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1	Zeiss		With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm
Software
Image analysis software	ImageJ
Analysis of mass spectrometry data	Protein Prospector	http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm	no
E.coli strains
OP50	CGC
RNAi bacteria
L4440	Julie Ahringer RNAi library
C. elegans mutants
CF2253	CGC, strain name: EJ1158	Genotype: gon-2(q388)
C. elegans transgenics
DCD214	Della David's lab at DZNE Tübingen	Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]
DCD215	Della David's lab at DZNE Tübingen	Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]