RNAi Feeding in Liquid Culture: A High-Throughput Method to Knockdown Gene Expression in C. elegans

Abstract

Quelle: Groh, N. et al. Methoden zur Untersuchung von Veränderungen in der inhärenten Proteinaggregation mit dem Alter in Caenorhabditis elegans. J. Vis. (2017).

RNAi ist ein leistungsstarkes genetisches Werkzeug, das C. elegans Forschern zur Verfügung steht. Dieses Video stellt eine Methode vor, um mehr Würmer mit RNAi zu behandeln als Plattenzuführen, indem flüssige Kulturbedingungen verwendet werden.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Groh et al, Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2017). 1. Flüssige Kultur von gonadenlosen Tieren zur Sammlung von jungen und gealterten Tieren, die RNAi ausgesetzt sind und auf ein Gen von Interesse abzielen …

Materials

Fernbach culture flask	Corning	4425-2XL	Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents	yes
Membrane Screw Cap	Schott	1E+06	GL45	yes
Nutating Mixer	VWR	444-0148		yes
Separatory funnel	Nalgene	4300-1000	Capacity 1,000 ml	no
1 ml syringe	BD Plastipak	3E+05		no
Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm	BD Microlance 3	3E+05		no
Membrane filters 0.025 µM	Millipore	VSWP04700		no
pH strip	Machery-Nagel	92110	pH-Fix 0-14	no
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	5E+09	Complete Mini EDTA-free tablets	no
Octoxynol-9	Applichem	A1388	Triton X-100	no
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	M1317		no
Nonylphenylpolyethylenglycol	Applichem	A1694	Nonidet P40 (NP40)	no
DNaseI	Roche	5E+09	recombinant, RNase free	no
RNaseA	Promega	A7973	solution	no
Total protein blot staining	Thermofisher	S11791	Sypro Ruby protein blot stain	no
Total protein gel staining	Thermofisher	S12001	Sypro Ruby protein gel stain	no
TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride)	Serva	36970		no
Iodoacetamide	Serva	26710		no
Ammoniumbicarbonate	Sigma-Aldrich	9830		no
Sequencing Grade Modified Trypsin	Promega	V5111		no
Isobaric tags for relative and absolute quantitation	Sciex	4E+06	iTRAQ Reagents Multiplex Kit	no
Centrifuge Avanti J-26XP	Beckmann Coulter	4E+05		yes
Ultracentrifuge Optima Max-XP	Beckmann Coulter	4E+05		no
Centrifuge 5424R	Eppendorf	5E+09		yes
Centrifuge 5702	Eppendorf	6E+09		yes
Centrifuge Megafuge 40R	Thermo Scientific	8E+07		no
Concentrator Plus	Eppendorf	5E+09	Centrifugal evaporator	no
Fluorescent stereo-microscope M165 FC	Leica		With Planapo 2.0x objective	no
Dissection microscope	Leica		Leica S6E	yes
High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1	Zeiss		With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm	no
Software				no
Image analysis software	ImageJ			no
Analysis of mass spectrometry data	Protein Prospector		http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm	no
E.coli strains
OP50	CGC
RNAi bacteria
L4440	Julie Ahringer RNAi library
C. elegans mutants
CF2253	CGC, strain name: EJ1158		Genotype: gon-2(q388)
C. elegans transgenics
DCD214	Della David's lab at DZNE Tübingen		Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]
DCD215	Della David's lab at DZNE Tübingen		Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]