तरल संस्कृति में आरएनएआई फीडिंग: सी एलिगेंस में जीन अभिव्यक्ति को नॉकआउट करने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट विधि

Abstract

स्रोत: ग्रोह, एन एट अल। कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंसमें उम्र के साथ अंतर्निहित प्रोटीन एकत्रीकरण में परिवर्तन का अध्ययन करने के तरीके। जे विस एक्सप्रेस। (2017).

RNAi शक्तिशाली आनुवंशिक उपकरण सी elegans शोधकर्ताओं के लिए उपलब्ध है । यह वीडियो तरल संस्कृति की स्थिति का उपयोग करके प्लेट फीडिंग की तुलना में आरएनएआई के साथ अधिक कीड़े का इलाज करने के लिए एक विधि का परिचय देता है।

Protocol

यह प्रोटोकॉल ग्रोह एट अलका एक अंश है, जो कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस, जे विस एक्सपीमें आयु के साथ अंतर्निहित प्रोटीन एकत्रीकरण में परिवर्तन का अध्ययन करने के तरीके हैं। (2017).

1. गोंड़-कम जानवरों की तरल संस्कृति युवा और वृद्ध जानवरों को इकट्ठा करने के लिए RNAi के अधीन ब्याज की एक जीन को लक्षित

नोट: RNAi के लिए कुछ जीन की प्रतिक्रिया तापमान निर्भर के रूप में पहले वर्णित किया जा सकता है । आरएनएआई के विकल्प के रूप में, एक उत्परिवर्ती जीन को गोन-2 (-) पृष्ठभूमि में शामिल किया जा सकता है।

1. तरल संस्कृति के लिए बैक्टीरिया की तैयारी
   1. OP50 और RNAi बैक्टीरिया तैयार (नियंत्रण के रूप में खाली वेक्टर के साथ वांछित dsRNA और बैक्टीरिया का उत्पादन बैक्टीरिया) संबंधित जीवाणु संस्कृति के 12 एमएल के साथ 4 एल पौंड माध्यम का ियोकुलकुलेट करके (50 μg/mL carbenicillin और RNAi जीवाणु संस्कृतियों के लिए 1 mM IPTG की अंतिम एकाग्रता जोड़ें) और उन्हें रात भर 180 बजे 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
   2. अगले दिन 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 6,700 x ग्राम पर संस्कृतियों की कटाई। सुपरनेटेंट को हटाएं और प्रत्येक गोली को 60 एमएल बर्फ-ठंडे एस बेसल मीडिया (100 mM NaCl, 50 m M पोटेशियम फॉस्फेट पीएच 6, बर्फ पर रखा) में फिर से खर्च करें। तीन पुनर्संपित छर्रों (OP50, नियंत्रण RNAAi बैक्टीरिया, और ब्याज के जीन के लिए RNAi बैक्टीरिया) 4 डिग्री सेल्सियस पर 1.2 कदम तक रखें।
      नोट: कीड़े को एल1 चरण से आरएनएआई पर या अंतिम लार्वा चरण एल 4 से विकासात्मक दोषों से बचने के लिए उगाया जा सकता है (चरण 1.2 देखें)।
2. आरएनएआई के साथ उपचार के लिए तरल संस्कृति पिछले लार्वा चरण L4 से शुरू
   1. फर्नबाख कल्चर फ्लास्क (क्षमता 2,800 एमएल) में 200 एमएल एस बेसल मीडिया जोड़ें। 300 एमएल की अंतिम संस्कृति मात्रा के लिए (1.2.2.4 देखें), 10 एमएल पोटेशियम साइट्रेट, पीएच 6 जोड़ें, 3 एमएल ट्रेस मेटल्स सॉल्यूशन (5 एमएम एथिलेंडियामेटेस्ट्रेक्टिक एसिड (ईडीटीए), 2.5 एमएम फेसो_4,1 एमएम एमएनएल_2,1 एमएम जेडएनएसओ₄, 0.1 m M CuSO_4),3 m M MgSO_4,3 mM CaCl_2,100 एनजी/एमएल कार्बेंडअजीम, और 5 μg/mL कोलेस्ट्रॉल) । एक झिल्ली स्क्रू कैप के साथ फ्लास्क बंद करें। बफ़र्स के व्यंजनों के लिए तालिका 1 को देखें।
   2. 25 डिग्री सेल्सियस में से एल1एस लें और उन्हें 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। 3 मिनट के लिए 1,900 x ग्राम पर सेंट्रलाइज, सुपरनेट को हटा दें, और 2 माइक्रोन प्रति एल1एस की गणना करें। पिछले चरण में तैयार फर्नबाख कल्चर फ्लास्क में 500,000 एल1एस जोड़ें।
   3. कीड़े की संख्या के लिए आनुपातिक रूप से OP50 (चरण 1.1 से) जोड़ें। उदाहरण के लिए, 500,000 कीड़े के लिए 60 एमएल OP50 जोड़ें।
   4. कुल मात्रा को 300 एमएल तक लाने के लिए एस बेसल के साथ पूर्ण कृमि संस्कृति। 150 आरपीएम के साथ एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में 25 डिग्री सेल्सियस पर एल 4 चरण तक कीड़ा संस्कृति को इनक्यूबेट करें।
   5. अगले दिन, कीड़े जंगली प्रकार L4s के आकार होना चाहिए। OP50 से आरएनएआई बैक्टीरिया को बदलने के लिए, छह 50 एमएल-ट्यूबों में जानवरों को इकट्ठा करें, उन्हें तलछट दें और सुपरनैंट को हटा दें। अवशिष्ट OP50 बैक्टीरिया को हटाने के लिए M4s के साथ L4s धोएं: 3 मिनट के लिए 1900 x g पर अपकेंद्रित्र, सुपरनेट को हटाएं और सभी एल4 को एक 50 एमएल-ट्यूब में स्थानांतरित करें। प्रति 5 माइक्रोन (कम से कम नौ बार) L4s गिनें। युवा कृमि संग्रह के लिए दो गुना 50,000 एल4एस की आवश्यकता होती है और वृद्ध कृमि संग्रह के लिए दो गुना 100,000 एल4एस की आवश्यकता होती है।
   6. 1.2.2.1 में वर्णित चार फर्नबाख संस्कृति फ्लास्क तैयार करें। प्रत्येक फ्लास्क में 50 माइक्रोग्राम/एमएल कार्बेनिकिन और 1 एमएम आईपीटीजी की अंतिम एकाग्रता भी जोड़ें।
   7. कीड़े की संख्या के लिए आनुपातिक रूप से ब्याज के जीन के लिए नियंत्रण आरएनएआई बैक्टीरिया और आरएनएआई बैक्टीरिया जोड़ें: युवा कीड़े के लिए प्रति फ्लास्क संबंधित बैक्टीरिया के 7 एमएल और वृद्ध कीड़े के लिए 14 एमएल प्रति फ्लास्क जोड़ें।
   8. युवा कृमि संग्रह के लिए 50,000 कीड़े प्रति फ्लास्क जोड़ें और वृद्ध कृमि संग्रह के लिए प्रति फ्लास्क 100,000 कीड़े, और 300 एमएल तक भरने के लिए एस बेसल के साथ संस्कृतियों को पूरा करें। कृमि संस्कृतियों (कुल में चार) को 25 डिग्री सेल्सियस और 150 आरपीएम पर इनक्यूबेट करें।

2. सी एलिगेंस तरल संस्कृतियों का रखरखाव

1. समय-समय पर प्रत्येक तरल संस्कृति से एक एलिकोट एकत्र करें और ग्लास स्लाइड पर रखें (वैकल्पिक रूप से एक आगर प्लेट पर) यह सत्यापित करने के लिए कि कोई संदूषण नहीं है। विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, विशेष रूप से विकास चरण के दौरान संस्कृति में बैक्टीरियल खाद्य स्तर की जांच करें। पहले से तैयार 2 एल नियंत्रण RNAi बैक्टीरिया और RNAi बैक्टीरिया के जीन के लिए ब्याज के जीन के लिए के रूप में कदम १.१ में वर्णित है । यदि आवश्यक हो तो इन्हें सी एलिगेंस तरल संस्कृतियों में जोड़ें और बाकी को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
2. समय-समय पर जांच करें कि जानवर बाँझ हैं। अधिकांश जानवरों के पास गोंड़ नहीं होगा। गोन-2 उत्परिवर्तन के पेनेट्रेंसी के आधार पर, कुछ ने गोंडल संरचनाओं का गर्भपात किया हो सकता है लेकिन अंडे वाले किसी भी जानवर को नहीं देखा जाना चाहिए।

स्टॉक समाधान	कुल धनराशि	अंतिम एकाग्रता	टिप्पणियां/विवरण
एस बेसल (500 एमएल के लिए: 5.9 ग्राम एनएसीएल, 50 एमएल 1 एम पोटेशियम फॉस्फेट पीएच 6)	200 एमएल		1 एम पोटेशियम फॉस्फेट पीएच 6: 1 एल के लिए: 129 ग्राम KH2PO4 मोनोबेसिक, 52 ग्राम K2HPO4 डिबेसिक निर्जल
1 एम पोटेशियम साइट्रेट पीएच 6 (400 एमएल के लिए: 13.1 ग्राम साइट्रिक एसिड मोनोहाइड्रेट, 134.4 ग्राम त्रिकोणीय पोटेशियम साइट्रेट मोनोहाइड्रेट)	3 एमएल	10 mm
धातुओं के समाधान का पता लगाने (1 एल के लिए: 1.86 ग्राम एथिलेंडियामाइनेट्रेसेटिक एसिड (ईडीटीए), 0.69 ग्राम FeSO4 · 7 H2O, 0.2 ग्राम MnCl2 · 4 H2O, 0.29 ग्राम ZnSO4 · 7 H2O, 0.025 ग्राम CuSO4 · 5 H2O)	3 एमएल		4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्टोर स्टॉक समाधान
1 एम MgSO4 (500 मिलीएल के लिए: 123.3 ग्राम)	900 माइक्रोल	3 एमएमएम
1 एम CaCl2 (500 एमएल के लिए: 73.5 ग्राम)	900 माइक्रोल	3 एमएमएम
200 μg/mL Carbendazim (50 मिलीएल के लिए: मेथनॉल में 10 मिलीग्राम)	150 माइक्रोल	100 एनजी/एमएल
5 मिलीग्राम/एमएल कोलेस्ट्रॉल (100 एमएल के लिए: इथेनॉल में 0.5 ग्राम)	300 माइक्रोल	5 μg/mL

तालिका 1.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fernbach culture flask	Corning	4425-2XL	Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents
Membrane Screw Cap	Schott	1E+06	GL45
Nutating Mixer	VWR	444-0148	yes
Separatory funnel	Nalgene	4300-1000	Capacity 1,000 ml
1 ml syringe	BD Plastipak	3E+05
Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm	BD Microlance 3	3E+05
Membrane filters 0.025 µM	Millipore	VSWP04700	no
pH strip	Machery-Nagel	92110	pH-Fix 0-14
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	5E+09	Complete Mini EDTA-free tablets
Octoxynol-9	Applichem	A1388	Triton X-100
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	M1317
Nonylphenylpolyethylenglycol	Applichem	A1694	Nonidet P40 (NP40)
DNaseI	Roche	5E+09	recombinant, RNase free
RNaseA	Promega	A7973	solution
Total protein blot staining	Thermofisher	S11791	Sypro Ruby protein blot stain
Total protein gel staining	Thermofisher	S12001	Sypro Ruby protein gel stain
TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride)	Serva	36970
Iodoacetamide	Serva	26710
Ammoniumbicarbonate	Sigma-Aldrich	9830
Sequencing Grade Modified Trypsin	Promega	V5111
Isobaric tags for relative and absolute quantitation	Sciex	4E+06	iTRAQ Reagents Multiplex Kit
Centrifuge Avanti J-26XP	Beckmann Coulter	4E+05
Ultracentrifuge Optima Max-XP	Beckmann Coulter	4E+05
Centrifuge 5424R	Eppendorf	5E+09
Centrifuge 5702	Eppendorf	6E+09
Centrifuge Megafuge 40R	Thermo Scientific	8E+07
Concentrator Plus	Eppendorf	5E+09	Centrifugal evaporator
Fluorescent stereo-microscope M165 FC	Leica		With Planapo 2.0x objective
Dissection microscope	Leica		Leica S6E
High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1	Zeiss		With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm
Software
Image analysis software	ImageJ
Analysis of mass spectrometry data	Protein Prospector	http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm	no
E.coli strains
OP50	CGC
RNAi bacteria
L4440	Julie Ahringer RNAi library
C. elegans mutants
CF2253	CGC, strain name: EJ1158	Genotype: gon-2(q388)
C. elegans transgenics
DCD214	Della David's lab at DZNE Tübingen	Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]
DCD215	Della David's lab at DZNE Tübingen	Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]