RNAi Feeding in Liquid Culture: En høygjennomstrømningsmetode for å slå ned genuttrykk i C. elegans

Abstract

Kilde: Groh, N. et al. Metoder for å studere endringer i iboende proteinaggregering med alder i Caenorhabditis elegans. J. Vis. Utt. (2017).

RNAi er et kraftig genetisk verktøy tilgjengelig for C. elegans-forskere. Denne videoen introduserer en metode for å behandle flere ormer med RNAi enn platefôring ved å bruke flytende kulturforhold.

Protocol

Denne protokollen er et utdrag fra Groh et al, Metoder for å studere endringer i iboende proteinaggregering med alder i Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2017).

1. Flytende kultur av gonadløse dyr for å samle unge og eldre dyr utsatt for RNAi rettet mot et gen av interesse

MERK: Responsen til noen gener til RNAi kan være temperaturavhengig som tidligere beskrevet. Som et alternativ til RNAi kan et mutantgen innlemmes i gon-2 (-) bakgrunn.

1. Forberedelse av bakterier for flytende kultur
   1. Forbered OP50- og RNAi-bakterier (bakterier som produserer ønsket dsRNA og bakterier med den tomme vektoren som kontroll) ved å inokulere 4 L LB-medium med 12 ml av den respektive bakteriekulturen (legg til en endelig konsentrasjon på 50 μg / ml carbenicillin og 1 mM IPTG til RNAi bakteriekulturer) og inkuber dem ved 37 ° C over natten ved 180 rpm.
   2. Neste dag høster kulturene på 6700 x g i 10 min ved 4 °C. Fjern supernatantene og resuspend hver pellets i 60 ml iskalde S basale medier (100 mM NaCl, 50 mM kaliumfosfat pH 6, holdt på is). Hold de tre resuspenderte pelletsene (OP50, kontroller RNAi-bakterier og RNAi-bakterier for genet av interesse) ved 4 °C til trinn 1.2.
      MERK: Ormer kan dyrkes på RNAi fra L1 stadium eller for å unngå utviklingsfeil fra siste larvaltrinn L4 (se trinn 1.2).
2. Flytende kultur for behandling med RNAi fra siste larvaltrinn L4
   1. Tilsett 200 ml S basale medier i en Fernbach-kulturflaske (kapasitet 2800 ml). For et endelig kulturvolum på 300 ml (se 1.2.2.4), tilsett 10 mM kaliumsitrat, pH 6, 3 ml Spormetaller oppløsning (5 mM etylendiamintetraketisk syre (EDTA), 2,5 mM FeSO_4,1 mM MnCl_2,1 mM ZnSO₄, 0,1 mM CuSO₄), 3 mM MgSO₄, 3 mM CaCl₂, 100 ng/ml carbendazim og 5 μg/ml kolesterol). Lukk kolben med en membranskruehette. Se tabell 1 for oppskrifter på buffere.
   2. Ta L1-ene ut av 25 °C og overfør dem til 15 ml rør. Sentrifuge på 1,900 x g i 3 min, fjern supernatanten, og tell L1-ene per 2 μL. Legg til 500.000 L1s i Fernbach-kulturflasken utarbeidet i forrige trinn.
   3. Legg til OP50 (fra trinn 1.1) proporsjonalt med antall ormer. For 500 000 ormer legger du for eksempel til 60 ml OP50.
   4. Komplett ormkultur med S basal for å bringe det totale volumet til 300 ml. Inkuber ormekulturen til L4-scenen ved 25 °C i en ristende inkubator med 150 o/min.
   5. Neste dag skal ormene være på størrelse med wild-type L4s. For å bytte fra OP50 til RNAi bakterier, samle dyr i seks 50 ml-rør, la dem sedimentere og fjerne supernatanten. Vask L4-ene med M9 for å fjerne gjenværende OP50-bakterier: sentrifuge ved 1900 x g i 3 min, fjern supernatanten og overfør alle L4-er til ett 50 ml rør. Tell L4-ene per 5 μL (minst ni ganger). To ganger 50 000 L4-er er nødvendig for den unge ormesamlingen, og to ganger er det nødvendig med 100 000 L4-er for den aldrende ormesamlingen.
   6. Forbered fire Fernbach kulturflasker som beskrevet i 1.2.2.1. Tilsett også en endelig konsentrasjon på 50 μg/ml Carbenicillin og 1 mM IPTG i hver kolbe.
   7. Legg til kontroll RNAi bakterier og RNAi bakterier for genet av interesse (fra trinn 1.1) proporsjonalt med antall ormer: Tilsett 7 ml av de respektive bakteriene per kolbe for unge ormer og 14 ml per kolbe for alderen ormer.
   8. Tilsett 50 000 ormer per kolbe for den unge ormesamlingen og 100 000 ormer per kolbe for den aldrende ormsamlingen, og fullfør kulturene med S basal for å fylle opp til 300 ml. Inkuber ormekulturene (fire totalt) ved 25 °C og 150 o/min.

2. Vedlikehold av C. elegans flytende kulturer

1. Samle regelmessig en aliquot fra hver flytende kultur og legg på en glasssklie (alternativt på en agarplate) for å bekrefte at det ikke er noen forurensninger. Ved hjelp av et disseksjonsmikroskop, sjekk bakteriell matnivå i kulturen, spesielt i vekstfasen. Forbered på forhånd 2 L kulturer av kontroll RNAi bakterier og RNAi bakterier for genet av interesse som beskrevet i trinn 1.1. Legg disse til C. elegans flytende kulturer om nødvendig og hold resten ved 4 °C.
2. Kontroller regelmessig at dyrene er sterile. De fleste dyr vil ikke ha en gonad. Avhengig av penetransen av gon-2-mutasjonen, kan noen ha avbrutt gonadale strukturer, men ingen dyr med egg bør observeres.

Lagerløsning	Beløpet	Endelig konsentrasjon	Kommentarer/beskrivelse
S basal (For 500 ml: 5,9 g NaCl, 50 ml 1 M kaliumfosfat pH 6)	200 ml		1 M Kaliumfosfat pH 6: For 1 L: 129 g KH2PO4 monobasisk, 52 g K2HPO4 dibasisk vannfri
1 M Kaliumsitrat pH 6 (For 400 ml: 13,1 g sitronsyremonohydrat, 134,4 g tri-kaliumsitratmonohydrat)	3 ml	10 mM
Spor metaller løsning (For 1 L: 1,86 g Etylendiamintetraacetisk syre (EDTA), 0,69 g FeSO4 · 7 H2O, 0,2 g MnCl2 · 4 H2O, 0,29 g ZnSO4 · 7 H2O, 0,025 g CuSO4 · 5 H2O)	3 ml		Oppbevar lagerløsning i mørket ved 4 °C
1 M MgSO4 (For 500 ml: 123,3 g)	900 μL	3 mM
1 M CaCl2 (For 500 ml: 73,5 g)	900 μL	3 mM
200 μg/ml carbendazim (For 50 ml: 10 mg i metanol)	150 μL	100 ng/ml
5 mg / ml kolesterol (For 100 ml: 0,5 g i etanol)	300 μL	5 μg/ml

Tabell 1.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fernbach culture flask	Corning	4425-2XL	Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents
Membrane Screw Cap	Schott	1E+06	GL45
Nutating Mixer	VWR	444-0148	yes
Separatory funnel	Nalgene	4300-1000	Capacity 1,000 ml
1 ml syringe	BD Plastipak	3E+05
Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm	BD Microlance 3	3E+05
Membrane filters 0.025 µM	Millipore	VSWP04700	no
pH strip	Machery-Nagel	92110	pH-Fix 0-14
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	5E+09	Complete Mini EDTA-free tablets
Octoxynol-9	Applichem	A1388	Triton X-100
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	M1317
Nonylphenylpolyethylenglycol	Applichem	A1694	Nonidet P40 (NP40)
DNaseI	Roche	5E+09	recombinant, RNase free
RNaseA	Promega	A7973	solution
Total protein blot staining	Thermofisher	S11791	Sypro Ruby protein blot stain
Total protein gel staining	Thermofisher	S12001	Sypro Ruby protein gel stain
TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride)	Serva	36970
Iodoacetamide	Serva	26710
Ammoniumbicarbonate	Sigma-Aldrich	9830
Sequencing Grade Modified Trypsin	Promega	V5111
Isobaric tags for relative and absolute quantitation	Sciex	4E+06	iTRAQ Reagents Multiplex Kit
Centrifuge Avanti J-26XP	Beckmann Coulter	4E+05
Ultracentrifuge Optima Max-XP	Beckmann Coulter	4E+05
Centrifuge 5424R	Eppendorf	5E+09
Centrifuge 5702	Eppendorf	6E+09
Centrifuge Megafuge 40R	Thermo Scientific	8E+07
Concentrator Plus	Eppendorf	5E+09	Centrifugal evaporator
Fluorescent stereo-microscope M165 FC	Leica		With Planapo 2.0x objective
Dissection microscope	Leica		Leica S6E
High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1	Zeiss		With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm
Software
Image analysis software	ImageJ
Analysis of mass spectrometry data	Protein Prospector	http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm	no
E.coli strains
OP50	CGC
RNAi bacteria
L4440	Julie Ahringer RNAi library
C. elegans mutants
CF2253	CGC, strain name: EJ1158	Genotype: gon-2(q388)
C. elegans transgenics
DCD214	Della David's lab at DZNE Tübingen	Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]
DCD215	Della David's lab at DZNE Tübingen	Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]