RNAi Alimentando-se em Cultura Líquida: Um Método de Alto Rendimento para Derrubar a Expressão Genética em C. elegans

Overview

RNAi é uma poderosa ferramenta genética disponível para pesquisadores de C. elegans. Este vídeo introduz um método para tratar mais vermes com RNAi do que alimentação de placas utilizando condições de cultura líquida.

Protocol

Este protocolo é um trecho de Groh et al, Métodos para Estudar Mudanças na Agregação De Proteína Inerente com Idade em Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2017).

1. Cultura líquida de animais sem gônadas para coletar animais jovens e idosos submetidos à RNAi visando um gene de interesse

NOTA: A resposta de alguns genes ao RNAi pode ser dependente de temperatura como descrito anteriormente. Como alternativa ao RNAi, um gene mutante poderia ser incorporado ao fundo gon-2(-) .

1. Preparação de bactérias para cultura líquida
   1. Preparar as bactérias OP50 e RNAi (bactérias que produzem o dsRNA desejado e bactérias com o vetor vazio como controle) inoculando 4 L LB médio com 12 mL da respectiva cultura bacteriana (adicione uma concentração final de 50 μg/mL carbenicilina e 1 mM IPTG às culturas bacterianas RNAi) e incuba-as a 37 °C durante a noite a 180 rpm.
   2. No dia seguinte, colher as culturas a 6.700 x g por 10 min a 4 °C. Remova os supernantes e resuspenda cada pelota em 60 mL de gelo gelado S mídia basal (100 mM NaCl, 50 mM Potassium fosfato pH 6, mantido no gelo). Mantenha as três pelotas resuspended (OP50, controle bactérias RNAi e bactérias RNAi para o gene de interesse) a 4 °C até o passo 1.2.
      NOTA: Os vermes podem ser cultivados em RNAi a partir do estágio L1 ou para evitar defeitos de desenvolvimento do último estágio larval L4 (ver passo 1.2).
2. Cultura líquida para tratamento com RNAi a partir da última fase larval L4
   1. Adicione 200 mL S de mídia basal em um frasco de cultura Fernbach (capacidade de 2.800 mL). Para um volume final de cultura de 300 mL (ver 1.2.2.4), adicione 10 mM de citrato de potássio, pH 6, Solução de metais trace 3 mL (5 mM ácido edenediaminetetraacético (EDTA), 2,5 mM FeSO₄, 1 mM MnCl₂, 1 mM ZnSO₂₄, 0,1 mM CuSO₄), 3 mM MgSO₄, 3 mM CaCl₂, 100 ng/mL carbendazim e 5 μg/mL colesterol). Feche o frasco com uma tampa de parafuso de membrana. Consulte a Tabela 1 para obter receitas de buffers.
   2. Tire os L1s de 25 °C e transfira-os para tubos de 15 mL. Centrifugar a 1.900 x g por 3 min, remover o supernascido e contar os L1s por 2 μL. Adicione 500.000 L1s no frasco de cultura Fernbach preparado na etapa anterior.
   3. Adicione OP50 (a partir da etapa 1.1) proporcionalmente ao número de worms. Por exemplo, para 500.000 worms adicione 60 mL OP50.
   4. Cultura completa de vermes com S basal para trazer o volume total para 300 mL. Incubar a cultura do verme até o estágio L4 a 25 °C em uma incubadora de agitação com 150 rpm.
   5. No dia seguinte, os vermes devem ser do tamanho de L4s tipo selvagem. Para mudar de OP50 para bactérias RNAi, coletar animais em seis tubos de 50 mL, deixá-los sedimentares e remover o supernasce. Lave os L4s com M9 para remover bactérias residuais OP50: centrífuga a 1900 x g por 3 min, remova o supernasal e transfira todos os L4s em um tubo de 50 mL. Conte os L4s por 5 μL (pelo menos nove vezes). Duas vezes 50.000 L4s são necessários para a coleção de vermes jovens e duas vezes 100.000 L4s são necessários para a coleta de vermes envelhecidos.
   6. Prepare quatro frascos da cultura fernbach, conforme descrito em 1.2.2.1. Adicione também uma concentração final de 50 μg/mL Carbenicillin e 1 mM IPTG a cada frasco.
   7. Adicione o controle das bactérias RNAi e bactérias RNAi para o gene de interesse (a partir da etapa 1.1) proporcionalmente ao número de vermes: Adicione 7 mL das respectivas bactérias por frasco para vermes jovens e 14 mL por frasco para os vermes envelhecidos.
   8. Adicione 50.000 vermes por frasco para a coleção de vermes jovens e 100.000 vermes por frasco para a coleta de vermes envelhecidos, e complete as culturas com S basal para encher até 300 mL. Incubar as culturas de vermes (quatro no total) a 25 °C e 150 rpm.

2. Manutenção de culturas líquidas C. elegans

1. Colete periodicamente uma alíquota de cada cultura líquida e coloque em um escorregador de vidro (alternativamente em uma placa de ágar) para verificar se não há contaminações. Usando um microscópio de dissecção, verifique os níveis de alimentos bacterianos na cultura especialmente durante a fase de crescimento. Prepare-se com antecedência 2 culturas L de controle bactérias RNAi e bactérias RNAi para o gene de interesse descrito na etapa 1.1. Adicione-as às culturas líquidas C. elegans, se necessário, e mantenha o resto a 4 °C.
2. Verifique periodicamente se os animais são estéreis. A maioria dos animais não terá uma gônus. Dependendo da penetração da mutação gon-2, alguns podem ter abortado estruturas gonadas, mas nenhum animal com ovos deve ser observado.

Solução de estoque	quantidade	Concentração final	Comentários/Descrição
S basal (Por 500 mL: 5,9 g NaCl, 50 mL 1 M fosfato de potássio pH 6)	200 mL		1 M potássico fosfato pH 6: Para 1 L: 129 g KH2PO4 monobásico, 52 g K2HPO4 anidro dibásico
1 M citrato de potássio pH 6 (Para 400 mL: 13,1 g de monohidrato de ácido cítrico, 134,4 g tri-potássio citrato monohidrato)	3 mL	10 mM
Solução de metais trace (Para 1 L: 1,86 g Ácido etilenodiaminetetraacético (EDTA), 0,69 g FeSO4 · 7 H2O, 0,2 g MnCl2 · 4 H2O, 0,29 g ZnSO4 · 7 H2O, 0,025 g CuSO4 · 5 H2O)	3 mL		Armazene a solução de estoque no escuro a 4 °C
1 M MgSO4 (Por 500 mL: 123,3 g)	900 μL	3 mM
1 M CaCl2 (Por 500 mL: 73,5 g)	900 μL	3 mM
200 μg/mL Carbendazim (Para 50 mL: 10 mgs em metanol)	150 μL	100 ng/mL
5 mg/mL Colesterol (Para 100 mL: 0,5 g em Etanol)	300 μL	5 μg/mL

Mesa 1.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fernbach culture flask	Corning	4425-2XL	Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents
Membrane Screw Cap	Schott	1E+06	GL45
Nutating Mixer	VWR	444-0148	yes
Separatory funnel	Nalgene	4300-1000	Capacity 1,000 ml
1 ml syringe	BD Plastipak	3E+05
Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm	BD Microlance 3	3E+05
Membrane filters 0.025 µM	Millipore	VSWP04700	no
pH strip	Machery-Nagel	92110	pH-Fix 0-14
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	5E+09	Complete Mini EDTA-free tablets
Octoxynol-9	Applichem	A1388	Triton X-100
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	M1317
Nonylphenylpolyethylenglycol	Applichem	A1694	Nonidet P40 (NP40)
DNaseI	Roche	5E+09	recombinant, RNase free
RNaseA	Promega	A7973	solution
Total protein blot staining	Thermofisher	S11791	Sypro Ruby protein blot stain
Total protein gel staining	Thermofisher	S12001	Sypro Ruby protein gel stain
TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride)	Serva	36970
Iodoacetamide	Serva	26710
Ammoniumbicarbonate	Sigma-Aldrich	9830
Sequencing Grade Modified Trypsin	Promega	V5111
Isobaric tags for relative and absolute quantitation	Sciex	4E+06	iTRAQ Reagents Multiplex Kit
Centrifuge Avanti J-26XP	Beckmann Coulter	4E+05
Ultracentrifuge Optima Max-XP	Beckmann Coulter	4E+05
Centrifuge 5424R	Eppendorf	5E+09
Centrifuge 5702	Eppendorf	6E+09
Centrifuge Megafuge 40R	Thermo Scientific	8E+07
Concentrator Plus	Eppendorf	5E+09	Centrifugal evaporator
Fluorescent stereo-microscope M165 FC	Leica		With Planapo 2.0x objective
Dissection microscope	Leica		Leica S6E
High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1	Zeiss		With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm
Software
Image analysis software	ImageJ
Analysis of mass spectrometry data	Protein Prospector	http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm	no
E.coli strains
OP50	CGC
RNAi bacteria
L4440	Julie Ahringer RNAi library
C. elegans mutants
CF2253	CGC, strain name: EJ1158	Genotype: gon-2(q388)
C. elegans transgenics
DCD214	Della David's lab at DZNE Tübingen	Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]
DCD215	Della David's lab at DZNE Tübingen	Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]