أربع طرق مقياس الشم المقايسة: طريقة لتقييم الردود أودورانت-Cued في Drosophila

Overview

ذباب الفاكهة لديها نظام الشم معقدة، يمكن أن تميز مئات من الروائح، واستخدام حاسة الشم لتوجيه القرارات السلوكية. يصف هذا الفيديو المقايسة الرباعية لقياس الشم، وهي طريقة لدراسة الاستجابات السلوكية الشمية في الذباب. يظهر مقطع البروتوكول المميز كيفية التعامل مع ذباب الاختبار وما هي الخطوات الهامة أثناء إجراء الفحص.

Protocol

هذا البروتوكول هو مقتطف من Lin et al., السلوكيات الشمية التي تم قياسها بواسطة تتبع الكمبيوتر ل Drosophila في مقياس أولفاكتوميتر رباعي، J. Vis. Exp. (2016).

1. الاستجابات السلوكية للروائح الجذابة والطاردة

1. قم بتشغيل وحدة التحكم في درجة الحرارة وتعيينها إلى 25 درجة مئوية.
2. قم بتوصيل غرف الروائح (التحكم واختبار الروائح) عن طريق إدخال الأنابيب إلى منفذ غرفة الرائحة و إلى تركيب الدفع إلى الاتصال على مربع السلوك.
3. تحقق من معدل التدفق في كل ربع باستخدام مقياس تدفق الهواء للتأكد من أن تيارات الهواء والتحكم والرائحة تساوي 100 مل / دقيقة.
4. تنظيف PTFE يطير الساحة ولوحات زجاجية مع 70٪ الإيثانول 2-3 مرات والسماح لهم للهواء الجاف تماما (~ 3-4 دقيقة).
5. لصق لوحات الزجاج إلى الساحة مع المشابك.
6. نقل الذباب دون CO_{2 التخدير} في الساحة من خلال ثقب في واحدة من لوحات الزجاج. بعد النقل، ضع شبكة دائرية على الحفرة لمنع الذباب من الهرب.
   ملاحظة: وقد ثبت CO_{2 التخدير} تؤثر على سلوك Drosophila وينبغي عدم استخدامها في غضون 24 ساعة من تجربة سلوكية.
7. ضع الحلبة مع الذباب في غرفة ضيقة الضوء، وربط تيارات الهواء التحكم الأربعة عن طريق ربط الأنابيب تعلق على دفع لربط المناسب على مربع السلوك إلى زوايا الساحة، وإغلاق باب الغرفة والانتظار 10-15 دقيقة للسماح للذباب التأقلم مع البيئة الجديدة. إذا كان ذلك ممكنا، قم بإطفاء الأنوار في الغرفة التي يتم فيها إجراء التجارب، لتجنب تسرب الضوء الأدنى المحتمل الذي قد يتحيز للنتيجة التجريبية.
8. قم بتشغيل تجربة تحكم لمدة 5-10 دقائق ، حيث يتعرض الذباب ل 4 تيارات هواء تحكم.
9. تحليل البيانات على الفور (انظر قسم تحليل البيانات أدناه) للتأكد من أن الذباب يتم توزيعها بشكل موحد في الساحة، ومؤشر الجذب هو ما يقرب من 0. هذه الخطوة ضرورية ، لأنها تتحقق من عدم وجود مصادر غير منضبطة للتفضيل أو التجنب داخل الحلبة(على سبيل المثال تسرب الضوء من الخارج ، والتوزيع غير المتكافئ لدرجة الحرارة ، والساحة غير المستوية ، وتلوث الرائحة ، وما إلى ذلك). إذا تم توزيع الذباب بشكل غير متساو أو كان نشاطه الحركي منخفضا ، فتخلص من الذباب ، وانظف الحلبة مرة أخرى (الخطوة 1.4) واستخدم دفعة جديدة من الذباب لتكرار التجربة.
10. قم بتوصيل غرفة الروائح الاختبارية بالإعداد عن طريق تشغيل الصمامات ثلاثية الاتجاه أو إعادة توصيل أنابيب الموصل.
11. تشغيل تجربة اختبار لمدة 5-10 دقيقة وتحليل البيانات كما نوقشت في القسم 2 أدناه (الشكل 1). التسجيلات أطول من 20 دقيقة يمكن أن يؤدي إلى ملفات البيانات التي قد يكون من الصعب معالجة حسابيا. إذا كانت التسجيلات التجريبية الأطول مرغوبة ، فتوقف بسرعة وإعادة تشغيل برنامج التتبع. وهذا يؤدي إلى فجوة ~ 10 ثانية بين التسجيلات التجريبية.
12. تجاهل الذباب.
13. تنظيف الساحة والزجاج لوحات مع الإيثانول 70٪ (الخطوة 1.4) واستبدال أنابيب موصل داخل الضميمة خفيفة ضيقة. لتسريع التجارب ، يمكن استخدام ساحة نظيفة جديدة ، وتنظيف الساحة القذرة أثناء إجراء الأشواط التجريبية.
14. تشغيل تجربة أخرى مع دفعة جديدة من الذباب، إذا لزم الأمر. إذا تم تشغيل العديد من التجارب في نفس اليوم، فاحرص على التأكد من عدم ترك أي رائحة في النظام من اختبار سابق. هذه ليست عادة مشكلة مع تركيزات منخفضة من الروائح أو مع CO₂، ولكن بالنسبة للمحفزات مركزة للغاية تصل إلى فجوة 24 ساعة بين أشواط التجريبية قد تكون هناك حاجة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استبدال جميع الأنابيب بعد أنابيب التدفق إذا اشتبه في تلوث الرائحة أثناء تجارب التحكم. اترك الهواء الجاف دائما بين التجارب لطرد النظام باستمرار.

2. تحليل البيانات

ملاحظة: يقوم برنامج اقتناء تتبع الذباب المقترح (المفصل في المواد) ، بتتبع الذباب في الوقت الفعلي أثناء الاستحواذ ، ويوفر الطابع الزمني وإحداثيات جميع الذباب المكتشف بتنسيق *.dat. لقد قمنا بتطوير روتين Matlab حسب الطلب لتحويل البيانات إلى تنسيق Matlab ، وتحليل البيانات. وترد أمثلة التعليمات البرمجية في المواد التكميلية، ولكن تفاصيل التنفيذ ستعتمد على البرمجيات المستخدمة في الحصول على البيانات.

1. تحميل البيانات الأولية. إنشاء قناع المكانية التي تتبع ملامح الساحة وتطبيق القناع على البيانات الخام لإزالة جميع نقاط البيانات التي تقع خارج الساحة لأنها تمثل الضوضاء (الشكل 2A، رمز التكميلي MaskSpatialFiltering.m، نقاط.m، DrawCircularMask.m).
2. إزالة جميع نقاط البيانات التي تتحرك بسرعة أقل من 0.163 سم / ثانية لفترة أطول من 3s، لأن هذه البيانات من المرجح أن تكون الضوضاء أو التي تم إنشاؤها بواسطة الذباب غير متحركة(الشكل 2B، رمز التكميلية الزمنية التصفية.m).
3. تصور نقاط البيانات المتبقية من خلال رسم كل منهم في كل مرة أو مسارات واحدة (الشكل 1، رمز تكميلي SingleTrajectoryViewer .m).
   ملاحظة: يعتمد موقع حدود الرائحة في الحقل الأربعة على الأرجح على عدد من العوامل ، مثل خصائص كل رائحة ومعدلات تدفق الهواء المستخدمة. على سبيل المثال ، من المرجح أن تملأ الروائح شديدة التقلب ربع الرائحة بشكل أكمل من الروائح الأقل تقلبا. وبالتالي، فمن المرجح أن كل رائحة قد يحمل حدود رائحة مختلفة قليلا. يمكن أن يكون استخدام كاشف التأين الضوئي لقياس حدود الرائحة مشكلة لأنه يستخدم فراغا لعينة الهواء من بقعة معينة ، وبالتالي يعطل تركيز الرائحة في تلك البقعة. ومع ذلك ، يمكن تقدير حدود الرائحة بسرعة استنادا إلى البيانات السلوكية للطيران. على سبيل المثال ، يمكن ملاحظة حدود الرائحة المستندة إلى مسارات الذباب المتراكمة استجابة للروائح المختلفة بوضوح في الشكل 1C و 1D.
4. حساب مؤشر الجذب لتحديد ما إذا كانت تجارب التحكم تولد أي استجابة تفضيل، وأيضا للوصول إلى الاستجابة لرائحة (أو optogenetic) التحفيز. لحساب مؤشر Attraction (الذكاء الاصطناعي)، استخدم آخر 5 دقائق من تسجيل عنصر التحكم أو الاختبار. للحصول على مقياس الجذب الذي يقع بين +1 (جاذبية مطلقة) و-1 (التنافر المطلق)، يتم استخدام الصيغة التالية لحساب الذكاء الاصطناعي:
   
   حيث _اختبار N هو عدد نقاط البيانات في ربع الاختبار، N عنصر_التحكم هو متوسط عدد نقاط البيانات في أرباع التحكم الثلاثة. هذا المقياس بديهي حيث لا يمكن الإشارة إلى أي تفضيل بقيم تقترب من الصفر. ومع ذلك، فإنه لا يشير بشكل صحيح إلى نسبة العدد الإجمالي للذباب التي تقع في الربع الرائحة. للحصول على هذا المقياس، يمكن استخدام مؤشر النسبة المئوية (PI):
   
   حيث _{يكون اختبار} N هو عدد نقاط البيانات في ربع الاختبار، ومجموع N_هو العدد الإجمالي لنقاط البيانات في جميع الأرباع الأربعة. توفر هذه الصيغة مقياسا يقع بين 0 و1، مع 0.25 مقابل أي تفضيل سلوكي(الشكل 1E و 2C، رمز الجذب التكميليIndex.m).
5. تشغيل 5-10 يكرر كل حالة تجريبية، وذلك باستخدام مجموعة جديدة من الذباب لكل تكرار. قارن فهارس الجذب بين الشروط أو ضد عناصر التحكم باستخدام اختبار Kolmogorov-Smirnov غير البارامترية (الشكل 1F، kstest2 الدالة في Matlab).

Representative Results

الشكل 1: مثال على البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام اختبار الشم أربعة حقول. (أ)تخطيطي من الساحة أربعة مجالات. (ب)لوحظت استجابات محايدة عندما تحتوي جميع الأرباع الأربعة على تغلغل الهواء الجاف فقط. (ج)الردود الجذب إلى تخفيف 6.25٪ من خل التفاح perfused من الربع العلوي الأيسر. (د) سلوكيات التنافر الناجمة عن 10٪ بروبيونات الإيثيل. في الشكل 2B-2D، يتم رسم مسار واحد من البيانات المكتسبة. يتم استخدام تدرج اللون للدلالة على المسار الزمني للتسجيل ، مع الألوان الزرقاء والحمراء هي بداية ونهاية التسجيلات ، على التوالي. (ه)مقارنة مؤشر الجذب (الذكاء الاصطناعي) ومؤشر النسبة المئوية (PI). (F)متوسط الذكاء الاصطناعي من 3-6 تجارب مع عدم وجود رائحة (التحكم)، خل التفاح (ACV) و 10٪ إيثيل بروبيونات (EP). تشير أشرطة الخطأ إلى SEM. تم تقييم الفرق الإحصائي من خلال اختبار Kolmogorov-Smirnov. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: مثال البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة خطوات تحليل البيانات. (أ)التصفية المكانية للبيانات، التي يقوم بها MaskSpatialFiltering.m لإزالة نقاط البيانات التي تقع خارج الساحة. تظهر الدوائر الحمراء المواقف الأولية للدوائر التي تستخدم لتحديد حدود الحلبة. الدوائر السوداء هي المواضع النهائية ، التي تم الحصول عليها عن طريق تركيب الخطوط العريضة للدائرة إلى البيانات (منطقة مظللة رمادية داخل أربعة حقول). تشير النقاط الحمراء ورؤوس الأسهم السوداء إلى نقاط البيانات التي سيتم إزالتها من مجموعة البيانات بعد خطوة التصفية هذه. (ب)التصفية الزمنية للبيانات، التي يؤديها التنفيس الزمني.m. تزيل خطوة التصفية هذه نقاط البيانات التي تتحرك ببطء شديد أو لا تتحرك على الإطلاق ، حيث من المرجح أن يتم إنشاؤها بواسطة الذباب غير المتحرك أو عن طريق الأوساخ / الانعكاسات من الحلبة. تشير النقطة الحمراء المحاطة بمربع أحمر متقطع إلى مواقع تبلغ حوالي 6000 نقطة بيانات مع إحداثيات متطابقة ستتم إزالتها بواسطة خطوة التصفية هذه. (ج)مؤشر الجذب (الذكاء الاصطناعي) ومؤشر النسبة المئوية (PI)، محسوبة في صناديق 10 ثانية على مدى آخر 5 دقائق من تجربة من قبل AttractionIndex.m. تحتوي الملامح الزمنية لهذه الفهارس على معلومات حول ديناميكيات الاستجابات السلوكية ويمكن استخدامها للتحليل التفصيلي للسلوكيات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ملف التعليمات البرمجية التكميلية. الرجاء الضغط هنا لعرض هذا الملف (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air delivery system			(Quantity needed)
Tubing and connectors
Thermoplastic NPT(F) Manifolds	Cole-Parmer, IL, USA	R-31522-31	1
Hex reducing nipple (1/4MNPT->1/8MNPT)	McMaster-Carr, IL, USA	5232T314	1
Tubing (ID:1/8)	McMaster-Carr, IL, USA	5108K43	50 Ft
Tubing (ID:1/16)	McMaster-Carr, IL, USA	52355K41	100 Ft
Barbed tube fittings	McMaster-Carr, IL, USA	5117K71	1 pack
Push-to-connect tube fittings	McMaster-Carr, IL, USA	5779K102	4
Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/8BF)	McMaster-Carr, IL, USA	5463K439	1 pack (10)
Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/8BF)	McMaster-Carr, IL, USA	5463K438	2 pack (10)
Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/16BF)	McMaster-Carr, IL, USA	5463K4	2 pack (10)
Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/4BF)	McMaster-Carr, IL, USA	5670K84	1
Hex head plug	McMaster-Carr, IL, USA	48335K152	1
Air pressure regulator, air filter and flowmeters			(Quantity needed)
Labatory gas drying unit	W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA	Model: L68-NP-303; stock #26840	1
Multitube frames for 150 mm flowtubes	Cole-Parmer, IL, USA	R03215-30	1
Multitube frames for 150 mm flowtubes	Cole-Parmer, IL, USA	R03215-76	1
150 mm flowtubes	Cole-Parmer, IL, USA	R-03217-15	9
Valve Cartridge	Cole-Parmer, IL, USA	R-03218-72	9
Precision Air regulator	McMaster-Carr, IL, USA	6162K13	1
Soleniod valves	Automate Scientific, Berkeley, CA	02-10i	4
Solenoid valve controller	ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA	18-Jan	1
Electronic flow meter	Honeywell	AWM3100V	1
DAQ (NI USB-6009, National Instruments) and a	National Instruments	NI USB-6009	1
Power supply	Extech Instruments	382200	1
Odor chambers
Polypropylene Wide Mouth jar 2 oz; 60 ml	Nalgene	562118-0002	At least 5 are required per experiment, but a separate chamber is required for each dillution of each odorant. Available at Container Store, part #635114)
Glass odor chamber, 0.25 oz	Sunburst Bottle	LB4B	At least 5 are required per experiment
"In" valve for odor chamber	Smart Products, Inc., CA, USA	214224PB-0011S000-4074	1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently
"Out" valve for odor chamber	Smart Products, Inc., CA, USA	224214PB-0011S000-4074	1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently
O ring	RT Dygert International, MN, USA	AS568-029 Buna-N O-R	1 pack (100)
Fly arena, camera and behavior boxes			(Quantity needed)
Behavior and camera box material	Interstate plastics, CA, USA	ABS black extruded (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php)	1803 sq inch
Teflon for fly arena and odor chamber inserts, 3/8" thick, 12" x 12"	McMaster-Carr, IL, USA	8545K27	1
Glass plates, 1/8" Thick, 9" x 9"	McMaster-Carr, IL, USA	8476K191	2
Dual action thermoelectric controller	WAtronix Inc, CA, USA	DA12V-K-0	1
IR LED array	Advanced Illumination, Rochester, VT, USA	AL4554-88024, PS24-TL	2 LED arrays and one power supply
Air conditioner Unit	Melcor Store	MAA280T-12	1
Imaging system			(Quantity needed)
Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5 mm F/1.4) C-mount Lens	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA	PEC21211 KP	1
CCXC-12P05N Interconnect Cable	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA	SOCCXC12P05N	1
DC-700 Camera Adapter	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA	SODC700	1
B+W 40,5 093 IR filter	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA	65-072442	1
TiFFEN 40.5 mm Circular polarizer	Amazon		1
IR Videocamera	Industrial Vision Source, FL, USA	Sony XC-EI50 (SY-XC-E150)	1
USB video converter	The Imagingsource, NC, USA	DFG/USB2-It	1
iFlySpy2 (fly tracking software)	Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com	iFlySpy2	1
IC Capture software	The Imagingsource, NC, USA	(http://www.theimagingsource.com/)
Miscellaneous			(Quantity needed)
Dremel rotary tool	Dremel, Racine, WI, USA	Dremel 8000-03	1
Diamond-coated drill bits for glass cutting	Available from various suppliers; MSC industrial Supply Co, Melville, NY	90606328	1