ארבעה כיווני Olfactometer Assay: שיטה להערכת תגובות אודורנט-Cued ב Drosophila

Overview

לזבובי הפירות יש מערכת חוש ריח מורכבת, הם יכולים להפלות מאות ריחות ולהשתמש בחוש הריח שלהם כדי לכוון החלטות התנהגותיות. סרטון זה מתאר את הבדיקה הרביעית של הריח, שיטה לחקר תגובות התנהגותיות חוש הריח בזבובים. סרטון הפרוטוקול המוצג מראה כיצד לטפל בזבובי בדיקה ומהם שלבים קריטיים בעת ביצוע הבדיקה.

Protocol

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך לין ואח ', התנהגויות חוש הריח Assayed על ידי מעקב מחשב של Drosophila ב Olfactometer ארבעה רבעים, J. Vis. Exp. (2016).

1. תגובות התנהגותיות לאודורנטים אטרקטיביים ודוחים

1. הפעל את בקר הטמפרטורה והגדר אותו ל 25 °C (69 °F).
2. חבר את תאי הריח (ריחות בקרה ובדיקה) על ידי החדרת הצינור לשקע של תא הריח ולהתאמת הדחיפה לחיבור בתיבת ההתנהגות.
3. בדוק את קצב הזרימה בכל רבע באמצעות מד זרימת האוויר כדי לוודא שזרמי האוויר של הבקרה והריח שווים ל- 100 מ"ל לדקה.
4. נקה את זירת הזבובים של PTFE ואת לוחות הזכוכית עם 70% אתנול 2-3 פעמים ולאפשר להם להתייבש לחלוטין באוויר (~ 3-4 דקות).
5. הדבק את לוחות הזכוכית לזירה עם מלחציים.
6. העבר זבובים ללא CO₂ הרדמה לתוך הזירה דרך החור באחת מצלחות הזכוכית. לאחר ההעברה, מניחים רשת עגולה על החור כדי למנוע זבובים לברוח.
   שים לב: CO₂ הרדמה הוכח להשפיע על התנהגות Drosophila ואין להשתמש בו בתוך 24 שעות של ניסוי התנהגותי.
7. מניחים את הזירה עם זבובים לתוך התא האור הדוק, לחבר את ארבעת זרמי האוויר שליטה על ידי חיבור צינורות המחוברים דחיפה לחיבור מתאים על תיבת ההתנהגות לפינות הזירה, לסגור את הדלת של התא ולחכות 10-15 דקות כדי לאפשר זבובים להתאקלם לסביבה החדשה. במידת האפשר, כבו את האורות בחדר שבו מבוצעים הניסויים, כדי למנוע דליפת אור מינימלית אפשרית שעלולה להטות את התוצאה הניסיונית.
8. הפעל ניסוי בקרה של 5-10 דקות, שבו זבובים נחשפים ל-4 זרמי אוויר שולטים.
9. נתח את הנתונים באופן מיידי (ראה סעיף ניתוח נתונים להלן) כדי לוודא שהזבובים מופצים באופן אחיד בזירה, ומדד המשיכה קרוב ל- 0. צעד זה הוא חיוני, שכן הוא מוודא כי אין מקורות בלתי מבוקרים של העדפה או הימנעות בתוך הזירה (למשל אור דולף מבחוץ, התפלגות טמפרטורה לא אחידה, זירה לא אחידה, זיהום ריח וכו '). אם הזבובים מופצים באופן לא שוויוני או שפעילות הלוקומוטור שלהם נמוכה, השליכו את הזבובים, נקו את הזירה שוב (שלב 1.4) והשתמשו בקבוצה חדשה של זבובים כדי לחזור על הניסוי.
10. חבר את תא ריח הבדיקה להגדרה על-ידי הפעלת השסתומים תלת-כיווניים או חיבור מחדש של צינורות המחבר.
11. הפעל ניסוי בדיקה למשך 5-10 דקות ונתח את הנתונים כפי שנדונו בסעיף 2 להלן (איור 1). הקלטות שאורכם עולה על 20 דקות עלולות לגרום לקבצי נתונים שעשויים להיות קשים לעיבוד חישובי. אם יש צורך בהקלטות ניסיוניות ארוכות יותר, עצור והפעל מחדש במהירות את תוכנית המעקב. התוצאה היא פער של ~ 10 שניות בין הקלטות ניסיוניות.
12. השלך זבובים.
13. נקה צלחות זירה וזכוכית עם 70% אתנול (שלב 1.4) והחלף צינורות מחברים בתוך המארז האזור. כדי לזרז ניסויים, ניתן להשתמש בזירה נקייה חדשה, ובזירה המלוכלכת מנקים תוך כדי ביצוע ריצות ניסיוניות.
14. הפעל ניסוי נוסף עם קבוצה חדשה של זבובים, במידת הצורך. אם מספר ניסויים מתבצעים באותו יום, יש להקפיד מאוד על כך שלא יישאר ריח במערכת מבדיקה קודמת. זה בדרך כלל לא בעיה עם ריכוזים נמוכים של ריחות או עם CO₂, אבל עבור גירויים מרוכזים מאוד עד פער של 24 שעות בין ריצות ניסיוני עשוי להיות נחוץ. בנוסף, כל צינורות לאחר צינורות זרימה ניתן להחליף אם זיהום ריח חשוד במהלך ניסויים שליטה. תמיד להשאיר את האוויר היבש על בין הניסויים כדי לשטוף ברציפות את המערכת.

2. ניתוח נתונים

שים לב: התוכנה המוצעת לרכישת מעקב זבובים (המפורטת בחומרים), עוקבת אחר זבובים בזמן אמת במהלך הרכישה, וחוסכת את חותמת הזמן וקואורדינטות של כל הזבובים שזוהו בפורמט *.dat. פיתחנו שגרת Matlab בהתאמה אישית כדי להמיר את הנתונים לפורמט Matlab, ולנתח את הנתונים. דוגמאות קוד מסופקות בחומרים משלימים, אך פרטי היישום יהיו תלויים בתוכנה המשמשת לרכישת נתונים.

1. טען את הנתונים הגולמיים. צור מסכה מרחבית העוקבת אחר קווי המתאר של הזירה והחל את המסכה על הנתונים הגולמיים כדי להסיר את כל נקודות הנתונים הנופלות מחוץ לזירה כפי שהם מייצגים רעש (איור 2A, מסכת קוד משלימהסינון מרחבי.m, ציון.m, מסכת ניקוד.m).
2. הסר את כל נקודות הנתונים הנעות במהירות נמוכה מ- 0.163 ס"מ/s למשך יותר מ- 3s, מכיוון שנתונים אלה עשויים להיות רעש או נוצרים על-ידי זבובים שאינם נעים(איור 2B, סינון זמני של קוד משלים.m).
3. דמיינו את נקודות הנתונים הנותרות על-ידי התוויית כולן בבת אחת או כמסלולים בודדים(איור 1, קוד משלים SingleTrajectoryViewer.m).
   שים לב: מיקום גבולות הריח בארבעת השדות תלוי ככל הנראה במספר גורמים, כגון המאפיינים של כל ריח וקצב זרימת האוויר הנמצא בשימוש. לדוגמה, ריחות נדיפים מאוד צפויים למלא את רבע הריח באופן מלא יותר מאשר ריחות נדיפים פחות. לכן, סביר להניח כי כל ריח עשוי להפגין גבולות ריח שונים במקצת. השימוש בגלאי פוטוניזציה למדידת גבולות ריח יכול להיות בעייתי מכיוון שהוא משתמש בוואקום כדי לדגום אוויר מנקודה מסוימת, ולכן משבש את ריכוז הריחות בנקודה זו. עם זאת, ניתן להעריך במהירות את גבולות הריח בהתבסס על נתוני התנהגות מעופפים. לדוגמה, גבול ריח המבוסס על מסלולי זבובים מצטברים בתגובה לריחות שונים ניתן לראות בבירור באיור 1C ו- 1D.
4. חשב מדד משיכה כדי לקבוע אם ניסויי בקרה אינם מייצרים תגובת העדפה, וגם כדי לגשת לתגובה לגירוי ריחני (או אופטוגנטי). כדי לחשב מדד משיכה (AI), השתמש ב- 5 דקות האחרונות של הקלטת פקד או בדיקה. כדי להשיג מידה של משיכה שנופלת בין +1 (משיכה מוחלטת) לבין -1 (דחייה מוחלטת), הנוסחה הבאה משמשת לחישוב הבינה המלאכותית:
   
   כאשר N_test הוא מספר נקודות הנתונים ברבע הבדיקה, N_control הוא המספר הממוצע של נקודות נתונים בשלושת רבעי הבקרה. מדד זה הוא אינטואיטיבי מכיוון ששום העדפה לא תצוין על-ידי ערכי כמעט אפס. עם זאת, הוא אינו מציין כראוי את חלקם של המספר הכולל של זבובים הממוקמים ברביע הריח. כדי להשיג מדד זה, ניתן להשתמש במדד אחוזים (PI):
   
   כאשר N_test הוא מספר נקודות הנתונים ברבע הבדיקה, _ו- N total הוא המספר הכולל של נקודות נתונים בכל ארבעת הרבעים. נוסחה זו מספקת מדד שנופל בין 0 ל- 1, עם 0.25 המתאימים ללא העדפה התנהגותית (איור 1E ו- 2C, קוד משלים AttractionIndex.m).
5. הפעל 5-10 חזרות של כל מצב ניסיוני, באמצעות קבוצה חדשה של זבובים עבור כל חזרה. השווה את מדדי המשיכה בין תנאים או כנגד פקדים באמצעות הבדיקה הלא-פרמטרית קולמוגורוב-סמירנוב(איור 1F, kstest2 פונקציה ב- Matlab).

Representative Results

איור 1: נתונים לדוגמה שנוצרו באמצעות מעיין חוש הריח בן ארבעת השדות. (A)סכמטי של זירת ארבעת השדות. (B)תגובות נייטרליות נצפות כאשר כל ארבעת הרבעים מכילים רק זלוף אוויר יבש. (C) תגובות משיכה לדילול של 6.25% של חומץ תפוחים חדור מהרביע העליון השמאלי. (D) התנהגויות דחייה מופעלות על ידי 10% אתיל propionate. באיור 2B-2D, מסלול בודד מהנתונים שנרכשו מותווה. מעבר צבע משמש כדי לסמן את מהלך הזמן של ההקלטה, עם צבעים כחולים ואדומים להיות ההתחלה והסוף של הקלטות, בהתאמה. (ה)השוואת מדד המשיכה (AI) ומדד האחוזים (PI). (F)ממוצע של AI של 3-6 ניסויים ללא ריח (בקרה), חומץ תפוחים סיידר (ACV) ו 10% אתיל Propionate (EP). קווי שגיאה מציינים SEM. הבדל סטטיסטי הוערך על ידי הבדיקה Kolmogorov-Smirnov. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: נתונים לדוגמה שנוצרו על-ידי שלבי ניתוח הנתונים. (A)סינון מרחבי של הנתונים, המבוצע על ידי MaskSpatialFiltering.m להסרת נקודות נתונים הנמצאות מחוץ לזירה. עיגולים אדומים מציגים עמדות ראשוניות של המעגלים המשמשים להגדרת גבולות הזירה. עיגולים שחורים הם המיקומים הסופיים, הנרכשים על-ידי התאמת קווי המתאר של העיגול לנתונים (אזור מוצלל אפור בתוך ארבעת השדות). נקודות אדומות וראשי חץ שחורים מציינים נקודות נתונים שיוסרו מערכת הנתונים לאחר שלב סינון זה. (B)סינון זמני של נתונים, המבוצע על-ידי סינון זמני.m. שלב סינון זה מסיר נקודות נתונים הנעות לאט מאוד או בכלל לא, שכן הן עשויות להיווצר על ידי זבובים שאינם נעים או על ידי לכלוך / השתקפויות מהזירה. נקודה אדומה המוקפת בתיבה אדומה מקווקוה מציינת מיקומים של ~ 6,000 נקודות נתונים עם קואורדינטות זהות שיוסרו על-ידי שלב סינון זה. (C) מדד משיכה (AI) ומדד אחוזים (PI), מחושב בפחים של 10 שניות במהלך 5 דקות האחרונות של ניסוי על ידי AttractionIndex.m. פרופילים זמניים של אינדקסים אלה מכילים מידע על הדינמיקה של תגובות התנהגותיות וניתן להשתמש בהם לניתוח מפורט של התנהגויות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ קוד משלים. נא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להוריד).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air delivery system			(Quantity needed)
Tubing and connectors
Thermoplastic NPT(F) Manifolds	Cole-Parmer, IL, USA	R-31522-31	1
Hex reducing nipple (1/4MNPT->1/8MNPT)	McMaster-Carr, IL, USA	5232T314	1
Tubing (ID:1/8)	McMaster-Carr, IL, USA	5108K43	50 Ft
Tubing (ID:1/16)	McMaster-Carr, IL, USA	52355K41	100 Ft
Barbed tube fittings	McMaster-Carr, IL, USA	5117K71	1 pack
Push-to-connect tube fittings	McMaster-Carr, IL, USA	5779K102	4
Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/8BF)	McMaster-Carr, IL, USA	5463K439	1 pack (10)
Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/8BF)	McMaster-Carr, IL, USA	5463K438	2 pack (10)
Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/16BF)	McMaster-Carr, IL, USA	5463K4	2 pack (10)
Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/4BF)	McMaster-Carr, IL, USA	5670K84	1
Hex head plug	McMaster-Carr, IL, USA	48335K152	1
Air pressure regulator, air filter and flowmeters			(Quantity needed)
Labatory gas drying unit	W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA	Model: L68-NP-303; stock #26840	1
Multitube frames for 150 mm flowtubes	Cole-Parmer, IL, USA	R03215-30	1
Multitube frames for 150 mm flowtubes	Cole-Parmer, IL, USA	R03215-76	1
150 mm flowtubes	Cole-Parmer, IL, USA	R-03217-15	9
Valve Cartridge	Cole-Parmer, IL, USA	R-03218-72	9
Precision Air regulator	McMaster-Carr, IL, USA	6162K13	1
Soleniod valves	Automate Scientific, Berkeley, CA	02-10i	4
Solenoid valve controller	ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA	18-Jan	1
Electronic flow meter	Honeywell	AWM3100V	1
DAQ (NI USB-6009, National Instruments) and a	National Instruments	NI USB-6009	1
Power supply	Extech Instruments	382200	1
Odor chambers
Polypropylene Wide Mouth jar 2 oz; 60 ml	Nalgene	562118-0002	At least 5 are required per experiment, but a separate chamber is required for each dillution of each odorant. Available at Container Store, part #635114)
Glass odor chamber, 0.25 oz	Sunburst Bottle	LB4B	At least 5 are required per experiment
"In" valve for odor chamber	Smart Products, Inc., CA, USA	214224PB-0011S000-4074	1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently
"Out" valve for odor chamber	Smart Products, Inc., CA, USA	224214PB-0011S000-4074	1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently
O ring	RT Dygert International, MN, USA	AS568-029 Buna-N O-R	1 pack (100)
Fly arena, camera and behavior boxes			(Quantity needed)
Behavior and camera box material	Interstate plastics, CA, USA	ABS black extruded (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php)	1803 sq inch
Teflon for fly arena and odor chamber inserts, 3/8" thick, 12" x 12"	McMaster-Carr, IL, USA	8545K27	1
Glass plates, 1/8" Thick, 9" x 9"	McMaster-Carr, IL, USA	8476K191	2
Dual action thermoelectric controller	WAtronix Inc, CA, USA	DA12V-K-0	1
IR LED array	Advanced Illumination, Rochester, VT, USA	AL4554-88024, PS24-TL	2 LED arrays and one power supply
Air conditioner Unit	Melcor Store	MAA280T-12	1
Imaging system			(Quantity needed)
Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5 mm F/1.4) C-mount Lens	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA	PEC21211 KP	1
CCXC-12P05N Interconnect Cable	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA	SOCCXC12P05N	1
DC-700 Camera Adapter	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA	SODC700	1
B+W 40,5 093 IR filter	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA	65-072442	1
TiFFEN 40.5 mm Circular polarizer	Amazon		1
IR Videocamera	Industrial Vision Source, FL, USA	Sony XC-EI50 (SY-XC-E150)	1
USB video converter	The Imagingsource, NC, USA	DFG/USB2-It	1
iFlySpy2 (fly tracking software)	Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com	iFlySpy2	1
IC Capture software	The Imagingsource, NC, USA	(http://www.theimagingsource.com/)
Miscellaneous			(Quantity needed)
Dremel rotary tool	Dremel, Racine, WI, USA	Dremel 8000-03	1
Diamond-coated drill bits for glass cutting	Available from various suppliers; MSC industrial Supply Co, Melville, NY	90606328	1