Четырехдневный анализ Ольфактометра: метод оценки ответов Одоранта-Кюда в Дрозофиле

Overview

Фруктовые мухи имеют сложную обонятельную систему, могут различать сотни запахов, и использовать их обоняние, чтобы направлять поведенческие решения. Это видео описывает четырехдневный анализ олфактометра, метод для изучения обонятельных поведенческих реакций у мух. Рекомендуемый протокол клип показывает, как обрабатывать тест мух и какие критические шаги при выполнении анализа.

Protocol

Этот протокол является выдержкой из Lin et al., Olfactory Behaviors, анализа компьютерного слежения за Дрозофилой в четырех квадрантном Олфактометре, J. Vis. Exp. (2016).

1. Поведенческие ответы на привлекательные и репелленты Odorants

1. Включите контроллер температуры и установите его до 25 градусов по Цельсию.
2. Подключите одорантные камеры (контроль и испытания пахантов), вставив трубки в розетку камеры запаха и push-to-connect установки на поле поведения.
3. Проверьте скорость потока в каждом квадранте с помощью счетчика воздушного потока, чтобы убедиться, что контроль и запах воздушных потоков равны 100 мл/мин.
4. Очистите арену PTFE и стеклянные пластины с 70% этанола 2-3 раза и дайте им полностью высохнуть воздуха (3-4 мин).
5. Прикрепите стеклянные пластины к арене с зажимами.
6. Передача мух без анестезии CO₂ в арену через отверстие в одной из стеклянных пластин. После передачи поместите круговую сетку на отверстие, чтобы предотвратить побег мух.
   ПРИМЕЧАНИЕ: CO₂ анестезии было показано, влияют на поведение Drosophila и не должны использоваться в течение 24 часов поведенческого эксперимента.
7. Поместите арену с мухами в светоутоляющие камеры, подключить четыре потока воздуха управления, подключив трубки прилагается к push-to-connect установки на поведение поле для арены углы, закрыть дверь камеры и ждать 10-15 минут, чтобы мухи акклиматизироваться к новой среде. Если это возможно, выключите свет в комнате, где проводятся эксперименты, чтобы избежать возможной минимальной утечки света, которая может привести к смещения экспериментального результата.
8. Запустите 5-10 мин контрольный эксперимент, в котором мухи подвергаются воздействию 4 потоков воздуха управления.
9. Проанализируйте данные немедленно (см. раздел анализа данных ниже), чтобы убедиться, что мухи равномерно распределены по арене, а индекс притяжения близок к 0. Этот шаг имеет важное значение, так как он проверяет, что нет неконтролируемых источников предпочтения или избегания в арене(например, утечка света извне, неравномерное распределение температуры, неравномерное арена, загрязнение запаха и т.д.). Если мухи распределены неравномерно или их активность локомотива низка, отбросьте мух, снова очистите арену (Шаг 1.4) и используйте новую партию мух, чтобы повторить эксперимент.
10. Подключите испытательную камеру запаха к установке, переключив 3-путьовые клапаны или повторно подключив разъем труб.
11. Вы запустите тестовый эксперимент в течение 5-10 минут и проанализируйте данные, обсуждаемые в разделе 2 ниже(рисунок 1). Записи продолжительной более 20 минут могут привести к обработке файлов данных, которые могут быть трудно обрабатывать с расчетом. Если требуется более длительные экспериментальные записи, быстро остановите и перенавечьте программу отслеживания. Это приводит к разрыву между экспериментальными записями в размере 10 сек.
12. Отбросьте мух.
13. Чистая арена и стеклянные пластины с 70% этанола (шаг 1.4) и заменить разъем труб в светоуготких корпуса. Для ускорения экспериментов можно использовать новую чистую арену, а грязную арену чистить во время выполнения экспериментальных пробежек.
14. При необходимости запустите еще один эксперимент с новой партией мух. Если в один и тот же день проводится несколько экспериментов, позаботьтесь об этом, чтобы убедиться, что от предыдущего тестового запуска в системе не осталось запаха. Это, как правило, не проблема с низкой концентрацией одорантов или с CO₂, но для высококонцентрированных стимулов до 24 часов разрыв между экспериментальными работает может потребоваться. Кроме того, все трубки после трубок могут быть заменены, если в ходе контрольных экспериментов подозревается загрязнение одорантом. Всегда оставляйте сухой воздух между экспериментами, чтобы непрерывно промыть систему.

2. Анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Предлагаемый летать отслеживания приобретения программного обеспечения (подробно описано в материалах), треки летит в режиме реального времени во время приобретения, и экономит время штамп и координаты всех обнаруженных мух в .dat формате. Мы разработали заказную программу Matlab для преобразования данных в формат Matlab и анализа данных. Примеры кода приведены в дополнительных материалах, но детали реализации будут зависеть от программного обеспечения, используемого для сбора данных.

1. Загрузите необработанные данные. Создайте пространственную маску, которая следует контурам арены и применить маску к необработанным данным, чтобы удалить все точки данных, которые выпадают за пределы арены, поскольку онипредставляют шум (рисунок 2A , Дополнительный код MaskSpatialFiltering.m, Оценка.m, DrawCircularMask.m).
2. Удалите все точки данных, которые движутся со скоростью ниже 0,163 см/с более 3 с, так как эти данные, вероятно, будут шумовыми или генерируются не движущиесямухами (рисунок 2B, Дополнительный код временногофильтра.m).
3. Визуализуйте оставшиеся точки данных, выназначив их все сразу илив качестве отдельных траекторий(рисунок 1 , Дополнительный код SingleTrajectoryViewer.m).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Расположение границ запаха в четырех полевых условиях, вероятно, зависит от ряда факторов, таких как характеристики каждого запаха и скорость воздушного потока используется. Например, высоко летучие одоранты, скорее всего, заполнить запах квадрант более полно, чем менее летучих запахов. Таким образом, вполне вероятно, что каждый одорант может проявлять несколько иной запах границ. Использование детектора фотоионизации для измерения границ запаха может быть проблематичным, поскольку он использует вакуум для образца воздуха из определенного места, и таким образом нарушает концентрацию запаха в этом месте. Тем не менее, границы запаха можно быстро оценить на основе поведенческих данных мухи. Например, граница запаха, основанная на кюветах мухоморов в ответ на различные запахи, хорошо наблюдается на рисунке 1C и 1D.
4. Рассчитайте индекс притяжения, чтобы определить, не генерируют ли контрольные эксперименты реакцию на предпочтения, а также получить доступ к ответу на одорант (или оптогенетический) стимул. Для расчета индекса привлекательности (AI) используйте последние 5 минут записи управления или теста. Чтобы получить меру притяжения, которая падает между No 1 (абсолютное притяжение) и -1 (абсолютное отвращение), для расчета ИИ используется следующая формула:
   
   где _N-тест – это количество точек данных в тестовом квадранте, N_{control –} это среднее количество точек данных в трех контрольных квадрантах. Эта мера интуитивно понятна, поскольку ни одно предпочтение не будет указано почти нулевыми значениями. Однако он неправильно указывает на долю от общего количества мух, которые находятся в квадранте запаха. Для получения этой меры может быть использован процентный индекс (PI):
   
   где _N-тест – это количество точек данных в тестовом квадранте, а N_всего – это общее количество точек данных во всех четырех квадрантах. Эта формула предусматривает меру, которая падает между 0 и 1, с 0,25, соответствующие никаких поведенческих предпочтений(рисунок 1E и 2C, Дополнительный код AttractionIndex.m).
5. Вы выполняете 5-10 повторов каждого экспериментального состояния, используя новую группу мух для каждого повтора. Сравните индексы притяжения между условиями или против элементов управления с помощью непаметрического теста Колмогорова-Смирнова(рисунок 1F,функция kstest2 в Matlab).

Representative Results

Рисунок 1: Пример данных, генерируемых с помощью четырех полевых офакторных анализов. (A)Схема четырех полевых арен. (B)Нейтральные реакции наблюдаются, когда все четыре квадранта содержат только сухую перфузию воздуха. (C)Привлечение ответы на 6,25% разбавления яблочного уксуса проникнуты из левого верхнего квадранта. (D)Поведение отталкивания вызвано 10% этилового пропионата. На рисунке 2B-2D построена единая траектория из полученных данных. Градиент цвета используется для обозначения времени записи, с синим и красным цветами, которые являются началом и концом записей, соответственно. (E)Сравнение индекса привлекательности (ИИ) и процентного индекса (PI). (F) Средний ИИ 3- 6 экспериментов без запаха (контроль), яблочный уксус (ACV) и 10% этил пропионат (EP). Бары ошибок указывают на SEM. Статистическая разница была оценена тестом Колмогорова-Смирнова. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Пример данных, генерируемых шагами анализа данных. (A)Пространственная фильтрация данных, выполняемая MaskSpatialFiltering.m для удаления точек данных, которые выпадают за пределы арены. Красные круги показывают начальные положения кругов, которые используются для определения границ арены. Черные круги являются окончательными позициями, приобретенными путем установки контуров круга к данным (серая затененная область внутри четырех полевых). Красные точки и черные наконечники стрел указывают на точки данных, которые будут удалены из набора данных после этого шага фильтрации. (B)Временная фильтрация данных, выполняемая TemporalFiltering.m. Этот шаг фильтрации удаляет точки данных, которые движутся очень медленно или вообще не двигаются, так как они могут быть созданы не движущихся мух или грязи / отражения от арены. Красная точка, окруженная пунктирной красной коробкой, указывает на положение 6000 точек данных с одинаковыми координатами, которые будут удалены этим шагом фильтрации. (C) Индекс привлекательности (AI) и процентный индекс (PI), рассчитанный в 10-секундных бункерах за последние 5 минут эксперимента AttractionIndex.m. Временные профили этих индексов содержат информацию о динамике поведенческих реакций и могут быть использованы для детального анализа поведения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Дополнительный файл кода. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл (Право нажмите, чтобы загрузить).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air delivery system			(Quantity needed)
Tubing and connectors
Thermoplastic NPT(F) Manifolds	Cole-Parmer, IL, USA	R-31522-31	1
Hex reducing nipple (1/4MNPT->1/8MNPT)	McMaster-Carr, IL, USA	5232T314	1
Tubing (ID:1/8)	McMaster-Carr, IL, USA	5108K43	50 Ft
Tubing (ID:1/16)	McMaster-Carr, IL, USA	52355K41	100 Ft
Barbed tube fittings	McMaster-Carr, IL, USA	5117K71	1 pack
Push-to-connect tube fittings	McMaster-Carr, IL, USA	5779K102	4
Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/8BF)	McMaster-Carr, IL, USA	5463K439	1 pack (10)
Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/8BF)	McMaster-Carr, IL, USA	5463K438	2 pack (10)
Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/16BF)	McMaster-Carr, IL, USA	5463K4	2 pack (10)
Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/4BF)	McMaster-Carr, IL, USA	5670K84	1
Hex head plug	McMaster-Carr, IL, USA	48335K152	1
Air pressure regulator, air filter and flowmeters			(Quantity needed)
Labatory gas drying unit	W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA	Model: L68-NP-303; stock #26840	1
Multitube frames for 150 mm flowtubes	Cole-Parmer, IL, USA	R03215-30	1
Multitube frames for 150 mm flowtubes	Cole-Parmer, IL, USA	R03215-76	1
150 mm flowtubes	Cole-Parmer, IL, USA	R-03217-15	9
Valve Cartridge	Cole-Parmer, IL, USA	R-03218-72	9
Precision Air regulator	McMaster-Carr, IL, USA	6162K13	1
Soleniod valves	Automate Scientific, Berkeley, CA	02-10i	4
Solenoid valve controller	ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA	18-Jan	1
Electronic flow meter	Honeywell	AWM3100V	1
DAQ (NI USB-6009, National Instruments) and a	National Instruments	NI USB-6009	1
Power supply	Extech Instruments	382200	1
Odor chambers
Polypropylene Wide Mouth jar 2 oz; 60 ml	Nalgene	562118-0002	At least 5 are required per experiment, but a separate chamber is required for each dillution of each odorant. Available at Container Store, part #635114)
Glass odor chamber, 0.25 oz	Sunburst Bottle	LB4B	At least 5 are required per experiment
"In" valve for odor chamber	Smart Products, Inc., CA, USA	214224PB-0011S000-4074	1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently
"Out" valve for odor chamber	Smart Products, Inc., CA, USA	224214PB-0011S000-4074	1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently
O ring	RT Dygert International, MN, USA	AS568-029 Buna-N O-R	1 pack (100)
Fly arena, camera and behavior boxes			(Quantity needed)
Behavior and camera box material	Interstate plastics, CA, USA	ABS black extruded (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php)	1803 sq inch
Teflon for fly arena and odor chamber inserts, 3/8" thick, 12" x 12"	McMaster-Carr, IL, USA	8545K27	1
Glass plates, 1/8" Thick, 9" x 9"	McMaster-Carr, IL, USA	8476K191	2
Dual action thermoelectric controller	WAtronix Inc, CA, USA	DA12V-K-0	1
IR LED array	Advanced Illumination, Rochester, VT, USA	AL4554-88024, PS24-TL	2 LED arrays and one power supply
Air conditioner Unit	Melcor Store	MAA280T-12	1
Imaging system			(Quantity needed)
Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5 mm F/1.4) C-mount Lens	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA	PEC21211 KP	1
CCXC-12P05N Interconnect Cable	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA	SOCCXC12P05N	1
DC-700 Camera Adapter	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA	SODC700	1
B+W 40,5 093 IR filter	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA	65-072442	1
TiFFEN 40.5 mm Circular polarizer	Amazon		1
IR Videocamera	Industrial Vision Source, FL, USA	Sony XC-EI50 (SY-XC-E150)	1
USB video converter	The Imagingsource, NC, USA	DFG/USB2-It	1
iFlySpy2 (fly tracking software)	Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com	iFlySpy2	1
IC Capture software	The Imagingsource, NC, USA	(http://www.theimagingsource.com/)
Miscellaneous			(Quantity needed)
Dremel rotary tool	Dremel, Racine, WI, USA	Dremel 8000-03	1
Diamond-coated drill bits for glass cutting	Available from various suppliers; MSC industrial Supply Co, Melville, NY	90606328	1