Overview
このビデオでは、Y迷路と呼ばれるフルーツフライの嗅覚探索行動をテストする方法について説明します。特色のプロトコルクリップは、アッセイを設定して実施する方法を示しています。
Protocol
このプロトコルテキストは、シモネらからの抜粋です, Y迷路アッセイとショウジョウバエの嗅覚をテスト, J. Vis. Exp.(2014).
1. 開始前
- 安定した、強い行動の現象型を持つ等分化された参照ストックを使用してください。すべての潜在的なコントロールは異種の背景対立を運ぶ可能性があるため、この在庫を選択するための一般的なルールはありません。
- 後のステップに必要な他のすべての在庫をバッククロスするには、この制御ひずみを使用します。この後退ステップは、通常、単一の処女女性の少なくとも5つの連続した十字架によって表される(相同染色体間の交差を可能にするために)2〜3等同性参照男性に。このステップは、異なるフライストック間の遺伝的背景を均質化することが重要です。
- 標準的なトウモロコシ粉(9%)、酵母(10%)、寒天培地(1.5%)で ショウジョウバエ の在庫を維持する25°Cで12時間の光/暗いサイクルで抗生物質(0.4%メチルパラヒドロキシ-安息香酸塩)を補完。
- 遠赤色光下の温度制御室(25°C)で化学感覚実験を行います(視覚的な手がかりの寄与を排除し、化学感覚信号に焦点を当てます)。定期的に各実験の間の領域を換気するために部屋の空気を更新します。
2. Y迷路アッセイを用いた嗅覚応答
- テストの前に濡れたペーパータオルを含むガラス管の25°Cで16-18時間ハエを飢えさせます。
- 2つのガラスバイアルと小さなプラスチックバイアル(ローディングバイアル)にY字型コネクタを接続します。泡ストッパーを通る1 mlのピペットチップを使用して、コネクタを3つのバイアルにリンクさせ、密閉されたY迷路を得ます。2つのピペット先端の狭い端を切り取り(直径2mm、一度決定を下したハエの戻りを避けるために)2つの「トラップ」バイアルを形成し、1つのピペット先端の大きな端を「ローディング」チューブを形成する(図1A)。
- 「トラップ」バイアル(図1B)を接続する直前に、各バイアルに直径6mmのフィルターペーパーを1枚配置します。1枚のフィルター紙に40μlの臭気溶液を加え、2番目のフィルター紙に対応する溶媒を40μl加えます。
- 「ローディング」バイアルに10匹の4〜9日齢のハエを導入します。この転移の間、CO2 麻酔は行動に強い影響を与えるので使用しないでください。むしろ氷の上で短い冷却を使用してください。麻酔付きハエの適切な操作は、被験者のストレスを可能な限り制限することが重要です。
- 遠赤色光下で25°CのY迷路試験を行い(可能な発熱源を制限するためにLED電球を使用)、可能な限り視覚刺激を避けてください。Y迷路(左側または右側にチューブを含む臭気、および前または後ろにチューブをロードする)の向きを交互に行うことに注意してください。図1C)。
- ハエが臭いまたは溶媒を含むトラップバイアルに入るのに数時間かかります。24時間後に飛ぶ数を数えて参加率を80%以上に増やし、最大嗅覚指数値(シモンネット、個人的なコミュニケーション)を提供します。
- 次の式を使用して、結果の嗅覚指数を計算します: (臭い管内の数 - 溶媒チューブ内の数)/ロードされたハエの総数。
- 次のようにY迷路のセットアップを洗う:一晩RBS 35 MDで解体されたセットアップを浸します。水道水で十分に洗い流します。最後に脱イオン水ですすいで乾燥させます。
3. データの統計分析
- データと変数に応じて、t検定、一方向の分散分析、または双方向の分散分析を実行します。
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Representative Results
図1:Y迷路セットアップで評価された男性嗅覚応答。A)デバイスを分割します。B)組み立てられた装置。C)遠赤色光下での作業状態でのセットアップ。D)酢酸(AA)またはフェニル酢酸(PAA)に対する雄の嗅覚応答の定量化は、蒸留水(10%v/v)で希釈(N=11、合計110ハエを表す)。統計分析は、データを0と比較するt検定を用いて行った。0 は、優先設定がないことを意味します。負の値は、臭気に対する嫌悪感を示し、正の値は引力を示します。: p < 0.0001;ns: 非有意 (p = 0.1680)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Polystyrene tube | VWR europe | 734-2255 | 30 x 25 mm Y-maze |
| Drosophila Borosilicate tube | Dijon verre | 95 X 25 mm Y-maze | |
| Foam stopper | Dutscher | 999038 | Y-maze |
| Y-shaped connector | Europrix | 11020605 | Y-maze |
| 100-1,000 µl pipette tips | Corning | 4868 | Join the following pipette tips to the Y-shaped connector. Cut 2 pipette tips at 65 mm from the wide end, and connect the narrow end (with a ~2 mm opening) to 2 test vials. These openings will limit the U-turns once the flies enter the tubes containing the odors. Cut 1 pipette tip at 35 mm from the wide end, and connect it to the loading vial. |
| Far-Red LED Bulb | Rubin-Lacaque | 0RB180238 | 625-630 nm |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 45725 | |
| Phenylacetic Acid | Sigma-Aldrich | P16621 | |
| Yeast | Sensient Flavors Strasbourg | 1018880464 | |
| Cornmeal | eurogerm | Farine de maïs | |
| Agar | Kalys | HP-697-25 | |
| Methyl hydroxy 4 benzoate | VWR international | 25605293 |
