Дрозофила Y-лабиринт анализа: метод оценки обонятельных ответов в мухах

Overview

Это видео описывает метод для проверки обонятельного исследовательского поведения в плодовой мухи, называется Y-лабиринт. Рекомендуемый протокол клип демонстрирует, как настроить и провести анализ.

Protocol

Этот текст протокола является выдержка из Симоннет и др.., Тестирование Drosophila Olfaction с Y-лабиринт анализа, J. Vis. Exp. (2014).

1. Перед началом

1. Используйте изогенный справочный запас со стабильными и надежными поведенческими фенотипами. Общего правила выбора этого запаса не существует, поскольку все потенциальные элементы управления могут нести неоднородные фоновые аллели.
2. Используйте этот контроль штамм для backcross любой другой запас, необходимый для дальнейших шагов. Этот шаг бэккроссинга, как правило, представлен по крайней мере 5 последовательных крестов одной девственной самки (чтобы позволить возможное пересечение между гомологичными хромосомами) до 2-3 изогенных эталонных самцов. Этот шаг имеет важное значение для гомогенизации генетического фона между различными запасами мух.
3. Поддерживать запасы дрозофилы на стандартной кукурузной муке (9%), дрожжах (10%) и агар-среде (1,5%) дополняется антибиотиком (0,4% метил-пара-гидрокси-бензоат) в 12-часовом светло-темном цикле при 25 градусах Цельсия.
4. Достичь химиосенсорных экспериментов в комнате, контролируемой температурой (25 градусов по Цельсию) под дальним красным светом (для устранения вклада визуальных сигналов, и сосредоточиться на химиосенсорных сигналов). Регулярно обновлять воздух комнаты, чтобы проветрить область между каждым экспериментом.

2. Обонятельный ответ с помощью анализа Y-лабиринта

1. Голодайте мух в течение 16-18 часов при 25 градусов по Цельсию в стеклянных трубках, содержащих мокрое бумажное полотенце перед тестированием.
2. Присоединяйтесь к разъему Y-формы до двух стеклянных флаконов и к меньшему пластиковому флакону (загрузочный флакон). Используйте 1 мл пипетки советы, которые проходят через пену пробки, чтобы связать разъем с тремя флаконами, и получить плотно запечатанный Y-лабиринт. Вырежьте узкие концы двух кончиков пипеток (диаметром 2 мм, чтобы избежать возврата мухи, как только она приняла решение) сформировать два "ловушки" флаконы, и большой конец одной наконечник пипетки, чтобы сформировать "загрузку" трубки (Рисунок 1A).
3. Перед подключением «ловушки» флаконов(рисунок 1B),поместите фильтровальную бумагу диаметром 6 мм в каждый флакон. Добавьте 40 мкл раствора одоранта на одну фильтровальную бумагу и 40 мкл соответствующего растворителя на второй фильтровальной бумаге.
4. Ввести десять от 4 до 9 дневных мух в "загрузку" флакона. Не используйте АНЕСТЕЗИю CO₂ во время этой передачи, так как она имеет сильное влияние на поведение. Скорее используйте краткое охлаждение на льду. Правильное манипулирование обезболивающими мухами важно, чтобы ограничить нагрузку на испытуемых как можно больше.
   1. Выполните серию Y-лабиринт испытаний при 25 градусов по Цельсию под дальним красным светом (с помощью светодиодных ламп для ограничения возможного источника нагрева), чтобы избежать визуальных стимулов как можно больше. Будьте осторожны, чтобы чередовать ориентации Y-лабиринты (запах, содержащий трубку слева, или справа, и загрузка трубки спереди или сзади; Рисунок 1C).
   2. Разрешить несколько часов для мух, чтобы войти в ловушку флакон, содержащий запах или растворитель. Граф летит после 24 часов, чтобы увеличить участие до более чем 80% и обеспечить максимальное обонятельное значение индекса (Simonnet, личное общение).
   3. Рассчитайте полученный обонятельный индекс по следующей формуле: (число в трубке запаха - число в растворительной трубке)/общее количество загруженных мух.
5. Вымойте Y-лабиринт настройки следующим образом: замочить демонтированы настройки в RBS 35 MD ночь. Тщательно промыть водопроводной водой. Наконец промыть деионизированной водой и высушить.

3. Статистический анализ данных

1. Выполните t-тест, одноуговую ANOVA или двухготовную ANOVA в зависимости от данных и переменных.

Representative Results

Рисунок 1: Мужской обонятельный ответ оценивается с Y-лабиринт настройки. A) Сплит-устройство. Б) Собранное устройство. C) Настройка в рабочем состоянии при крайнем красном свете. D) Количественная оценка мужских обонятельных реакций на уксусную кислоту (АА) или фенилакетическую кислоту (ПАА), разбавленную дистиллированной водой (10% v/v) (N No 11, что составляет в общей сложности 110 мух). Статистический анализ проводился с помощью t-теста, сравнивая данные с 0. 0 означает отсутствие предпочтений. Отрицательное значение указывает на отвращение к одоранту и положительное значение притяжения. : p lt; 0.0001; ns: не значительный (р 0,1680). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila Polystyrene tube	VWR europe	734-2255	30 x 25 mm Y-maze
Drosophila Borosilicate tube	Dijon verre		95 X 25 mm Y-maze
Foam stopper	Dutscher	999038	Y-maze
Y-shaped connector	Europrix	11020605	Y-maze
100-1,000 µl pipette tips	Corning	4868	Join the following pipette tips to the Y-shaped connector. Cut 2 pipette tips at 65 mm from the wide end, and connect the narrow end (with a ~2 mm opening) to 2 test vials. These openings will limit the U-turns once the flies enter the tubes containing the odors. Cut 1 pipette tip at 35 mm from the wide end, and connect it to the loading vial.
Far-Red LED Bulb	Rubin-Lacaque	0RB180238	625-630 nm
Acetic Acid	Sigma-Aldrich	45725
Phenylacetic Acid	Sigma-Aldrich	P16621
Yeast	Sensient Flavors Strasbourg	1018880464
Cornmeal	eurogerm	Farine de maïs
Agar	Kalys	HP-697-25
Methyl hydroxy 4 benzoate	VWR international	25605293