Overview
وقد خصصت يرقات دروسوفيلا الخلايا العصبية الحسية-nociceptors- التي تؤدي استجابتها للمحفزات الحرارية الضارة المحتملة إلى سلوكيات جانبية أو ما يسمى ب "nocifensive" في الحيوان. يصف هذا الفيديو طريقة لتقييم nociception الحرارية عن طريق تسجيل سلوك اليرقات استجابة للتطبيق المحلي للمسبار الحراري على السفاح. ولذلك، تسمى هذه الطريقة المقايسة المحلية للتحقيق الحراري.
Protocol
هذا البروتوكول هو مقتطف من Chattopadhyay وآخرون., الأساليب المحلية والعالمية لتقييم Nociception الحرارية في يرقات Drosophila, J. Vis. Exp. (2012).
1. المحلية اختبار مسبار الحرارة
نحن نقدم حافزا حراريا ضارا لشريحة جسم يرقات فردية باستخدام مسبار حراري مصمم خصيصا تم تصنيعه من قبل Pro-Dev Engineering (انظر جدول المواد). على الرغم من أن هذا المسبار لديه ميزات التصميم الأمثل (طرف معدني صغير من ~ .07 مم2 المنطقة والقدرة على الحفاظ على وجه التحديد درجة حرارة نقطة محددة من 23 درجة مئوية إلى 65 درجة مئوية) من حيث المبدأ أي أداة مع طرف صغير التي يمكن تسخينها إلى درجة حرارة محددة لفترة تصل إلى 20 ثانية ينبغي أن يكفي. يستخدم طرف المسبار لتحفيز يرقات النجمةالثالثة المبكرة على الخط الوسطي الظهري بدقة في الجزء البطني A4 (انظر الشكل 1). استجابة لهذا التحفيز الحراري ، ستعرض اليرقات بشكل عام سلوك انسحاب معكوس من الدوران أفقيا بمقدار 360 درجة أو أكثر. هذا السلوك يختلف عن استجابتهم لمسة خفيفة لمسة لمسة غير ضارة درجة حرارة الغرفة المعدنية التحقيق الذي ينطوي عموما على وقفة قصيرة في نشاطهم الحركي.
بروتوكول لإجراء فحص مسبار الحرارة:
- درجة حرارة محددة مسبقا للمسبار الحراري إلى نقطة المجموعة المطلوبة.
- استخدم فرشاة طلاء أو ملقط لنقل يرقة فردية برفق على منصة مسطحة (نستخدم عادة قطعة صغيرة من الفينيل مقطوعة من الموثق) والتي سيتم تحفيز اليرقات عليها لاحقا. يجب تغطية اليرقة بكمية رقيقة من الماء قبل ملامسة المسبار الحراري. يجب أن يكون فيلم الماء الذي يغطي اليرقة أقل قدر ممكن ويغطي اليرقة تماما ، مع ضمان عدم جفاف اليرقة عند لمس الفينيل.
- اضغط برفق على طرف المسبار ضد اليرقة في الجزء A4 الذي يطبق ضغط الضوء مع الطرف بزاوية 45 درجة بين المسبار وسطح اليرقة (انظر الشكل 1). يجب أن يسبب الضغط مسافة بادئة طفيفة على سطح اليرقة وعادة ما يكون كافيا لمنع الحركة. إذا استمرت اليرقة في التحرك ، فطبق ضغطا أكبر قليلا وستتوقف عادة. لا تسجل بيانات من اليرقات التي تتجاوز مجال الرؤية أو التي لا يمكن تحقيق اتصال مسبار مستمر لها حتى الاستجابة أو قطع 20 s.
- استمر في تحفيز اليرقة حتى يتم عرض استجابة الانسحاب أو حتى يتم الوصول إلى قطع 20 ثانية ، أيهما يحدث أولا. عادة ما تظهر اليرقات المستجيبة أولا سلوكا أوليا لرفع الرأس والذيل. ويتبع ذلك عادة سلوك الانسحاب من المتداول على الأقل 360 درجة. يتم تسجيل لفة كاملة فقط من 360 درجة كتتصرف nocifensive (رفع الرأس أو الذيل الأولية ليست كذلك).
- بمجرد بدء سلوك الانسحاب الإفراج عن الاتصال مع التحقيق وتسجيل الكمون أو الوقت للانسحاب. إذا لم يتم ملاحظة أي سلوك انسحاب في غضون 20 ثانية ، فإن اليرقة هي غير مستجيبة. يمكن تقسيم المستجيبين إلى فئتين. إذا ظهر سلوك الانسحاب في غضون 5 ثوان ، فإن اليرقة هي المستجيب السريع. إذا ظهر سلوك الانسحاب بين 5-20 ثانية ، فإن اليرقة هي المستجيب البطيء (انظر الشكل 1 في Babcock وآخرون . (بيول) (2009)).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الشكل 1: إعداد تجريبي لإجراء فحص حراري محلي. يتم التحكم في مسبار الحرارة من قبل وحدة التحكم الحراري التي تستخدم لتعيين والحفاظ على درجة حرارة المسبار. يقام المسبار عموديا على المحور الأمامي ويستخدم لتحفيز اليرقة بزاوية 45 درجة إلى الأفقي. يتم إجراء اتصال التحقيق على وجه التحديد في الجزء البطني A4 كما هو مبين. يجب على المستخدم الحفاظ على هذا الاتصال مع ضغط لطيف حتى قطع 20 ثانية أو حتى يبدأ السلوك المتداول. إذا كان ينظر إلى درجة الحرارة على أنها ضارة ، فإن اليرقة تظهر سلوك انسحاب معكوس يتميز بلفة واحدة على الأقل 360 درجة. يمكن أن يكون عدد القوائم مفردا أو متعددا (انظر الشكل 2B). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحديد حجم الاستجابة السلوكية باستخدام اختبار مسبار الحرارة. (أ)مؤامرة من النسبة المئوية من المستجيبين الذين ينتمون إلى كل فئة (سريع، بطيء، وغير المستجيبين) مقابل درجة الحرارة. (ب)مؤامرة من الكمون إلى سلوك الانسحاب العكسي مقابل عدد لفات كل يرقة عرضت في أربع درجات حرارة اختبار مختلفة من زيادة الضارة (42 درجة مئوية، 44 درجة مئوية، 46 درجة مئوية، 48 درجة مئوية، 50 درجة مئوية، و 52 درجة مئوية). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermal Probe | Pro-Dev Engineering | Custom-built on demand | Contact information can be provided on request |
| Leica DFC290 12v/400mA Color camera | Leica Microsystems | 12730080 | Any equivalent camera will do. |
| Leica MZ6 microscope | Leica Microsystems | Part number for MZ6 zoom body (optics carrier) is 10445614 | |
| Schott Ace Modulamp Unit | Schott AG | A20500 | |
| Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide | Schott AG | Schott A08575 | |
| Thermal Control Unit | TSCI corp. | Custom Built | Details can be provided on request |
| Zeiss Stemi 2000 microscope | Carl Zeiss, Inc. | NT55-605 | Any equivalent microscope will do. |
| Forceps | Fine Science Tools | FS-1670 | |
| Paintbrush | Blick Art Materials | 06762-1002 | |
| 35 X 10 mm Polystyrene Petri Dish | Falcon BD | 351008 | We have not tested alternative dishes. |
| Piece of vinyl | Office Depot | 480009 |
