Lokal varmesondeanalyse: En metode til vurdering af nociception af høje temperaturer i Drosophila Larver

Overview

Drosophila larver har dedikerede sensoriske neuroner-nociceptors-hvis reaktion på potentielt skadelige termiske stimuli udløser aversive-eller såkaldte "nocifensive"-adfærd i dyret. Denne video beskriver en metode til at vurdere termisk nociception ved at registrere larveadfærd som reaktion på lokal anvendelse af en varmesonde på neglebåndet. Denne metode kaldes derfor den lokale varmesondeanalyse.

Protocol

Denne protokol er et uddrag fra Chattopadhyay et al.,Lokale og globale metoder til vurdering af termisk nociception i Drosophila Larver, J. Vis. Exp. (2012).

1. Lokal varmesonde assay

Vi leverer en skadelig termisk stimulus til et individuelt larvehussegment ved hjælp af en specialbygget termisk sonde fremstillet af Pro-Dev Engineering (se Materialetabel). Selv om denne sonde har optimale designfunktioner (en lille metalspids på ~ 0,07 mm^2-område og evnen til præcist at opretholde en fast punkttemperatur fra 23 °C til 65 °C), bør ethvert værktøj med en lille spids, der kan opvarmes til en bestemt temperatur i en periode på op til 20 sekunder, være tilstrækkeligt. Sondespidsen bruges til at stimulere tidlige 3^rd instar larver netop på den dorsale midterlinje i abdominalsegmentet A4 (se figur 1). Som svar på denne termiske stimulus vil larver generelt udvise en afvisende tilbagetrækningsadfærd ved at rulle sideværts med 360 grader eller mere. Denne adfærd adskiller sig fra deres lette berøringsrespons på en ikke-skadelig rumtemperatur metalsonde, som generelt indebærer en kort pause i deres locomotory aktivitet.

Protokol for varmesondeanalysen:

1. Forudindstillet temperatur på den termiske sonde til det ønskede sætpunkt.
2. Brug en pensel eller pincet til forsigtigt at overføre en individuel larve på en flad platform (vi bruger normalt et lille stykke vinyl skåret fra et bindemiddel), hvor larverne efterfølgende stimuleres. Larven skal være dækket af en tynd film af vand før kontakt med den termiske sonde. Filmen af vand, der dækker larven, skal være så lidt som muligt og helt dække larven, samtidig med at larven ikke er tør, når man rører vinylen.
3. Tryk forsigtigt sondespidsen mod larven i segment A4 med et lystryk med spidsen i ca. 45° vinkel mellem sonden og larvens overflade (se figur 1). Trykket skal forårsage en lille indrykning på larvens overflade og vil normalt være tilstrækkeligt til at forhindre bevægelse. Hvis larven fortsætter med at bevæge sig, skal du anvende lidt mere tryk, og det vil normalt stoppe. Registrer ikke data fra larver, der bevæger sig ud over synsfeltet, eller for hvilke der ikke kan opnås konstant sondekontakt før respons eller 20 s cutoff.
4. Fortsæt med at stimulere larven, indtil en tilbagetrækning svar er udstillet, eller indtil de 20 sekunder cutoff er nået, alt efter hvad der sker først. Reagerende larver viser typisk først en foreløbig opførsel ved at løfte hoved og hale. Dette efterfølges normalt af tilbagetrækningsadfærden ved at rulle mindst 360 grader. Kun en komplet rulle på 360 grader er scoret som nocifensive adfærd (den foreløbige hoved eller hale rejse er ikke).
5. Når tilbagetrækning adfærd er indledt frigivelse kontakt med sonden og registrere latenstid eller tid til tilbagetrækning. Hvis der ikke observeres nogen tilbagetrækningsadfærd inden for 20 sekunder, er larven en ikke-responder. Respondenterne kan opdeles yderligere i 2 kategorier. Hvis tilbagetrækningsadfærden vises inden for 5 sekunder, er larven en hurtig responder. Hvis tilbagetrækningsadfærden vises mellem 5-20 sekunder, er larven en langsom responder (se figur 1 i Babcock et al., Curr. Biol. (2009)).

Representative Results

Figur 1: Eksperimentel opsætning til lokal varmesondeanalyse. Varmesonden styres af en termisk styreenhed, der bruges til at indstille og opretholde sondens temperatur. Sonden holdes vinkelret på anteroposterior aksen og bruges til at stimulere larven i en vinkel på 45° til vandret. Sonde kontakt er lavet specielt på abdominal segment A4 som vist. Brugeren skal opretholde denne kontakt med blidt tryk indtil den 20 sekunders afskæring, eller indtil rulleadfærden begynder. Hvis temperaturen opfattes som skadelig, vil larven vise en afvisende tilbagetrækningsadfærd karakteriseret ved mindst en 360 ° rulle. Antallet af ruller kan være enkelt eller flere (se figur 2B). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Kvantificering af adfærdsmæssig respons ved hjælp af varmesondens analyse. (A) Plot af procentdelen af respondenter, der tilhører hver kategori (hurtig-, langsom-, og ikke-responders) versus temperatur. (B) Område med latenstid for aversiv tilbagetrækningsadfærd i forhold til antallet af ruller, hver larve udviser ved fire forskellige testtemperaturer med stigende skadelighed (42 °C, 44 °C, 46 °C, 48 °C, 50 °C og 52 °C). Klik her for at se en større version af dette tal.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thermal Probe	Pro-Dev Engineering	Custom-built on demand	Contact information can be provided on request
Leica DFC290 12v/400mA Color camera	Leica Microsystems	12730080	Any equivalent camera will do.
Leica MZ6 microscope	Leica Microsystems	Part number for MZ6 zoom body (optics carrier) is 10445614
Schott Ace Modulamp Unit	Schott AG	A20500
Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide	Schott AG	Schott A08575
Thermal Control Unit	TSCI corp.	Custom Built	Details can be provided on request
Zeiss Stemi 2000 microscope	Carl Zeiss, Inc.	NT55-605	Any equivalent microscope will do.
Forceps	Fine Science Tools	FS-1670
Paintbrush	Blick Art Materials	06762-1002
35 X 10 mm Polystyrene Petri Dish	Falcon BD	351008	We have not tested alternative dishes.
Piece of vinyl	Office Depot	480009