Denne protokol er et uddrag fra Chattopadhyay et al.,Lokale og globale metoder til vurdering af termisk nociception i Drosophila Larver, J. Vis. Exp. (2012).
1. Lokal varmesonde assay
Vi leverer en skadelig termisk stimulus til et individuelt larvehussegment ved hjælp af en specialbygget termisk sonde fremstillet af Pro-Dev Engineering (se Materialetabel). Selv om denne sonde har optimale designfunktioner (en lille metalspids på ~ 0,07 mm2-område og evnen til præcist at opretholde en fast punkttemperatur fra 23 °C til 65 °C), bør ethvert værktøj med en lille spids, der kan opvarmes til en bestemt temperatur i en periode på op til 20 sekunder, være tilstrækkeligt. Sondespidsen bruges til at stimulere tidlige 3rd instar larver netop på den dorsale midterlinje i abdominalsegmentet A4 (se figur 1). Som svar på denne termiske stimulus vil larver generelt udvise en afvisende tilbagetrækningsadfærd ved at rulle sideværts med 360 grader eller mere. Denne adfærd adskiller sig fra deres lette berøringsrespons på en ikke-skadelig rumtemperatur metalsonde, som generelt indebærer en kort pause i deres locomotory aktivitet.
Protokol for varmesondeanalysen:
- Forudindstillet temperatur på den termiske sonde til det ønskede sætpunkt.
- Brug en pensel eller pincet til forsigtigt at overføre en individuel larve på en flad platform (vi bruger normalt et lille stykke vinyl skåret fra et bindemiddel), hvor larverne efterfølgende stimuleres. Larven skal være dækket af en tynd film af vand før kontakt med den termiske sonde. Filmen af vand, der dækker larven, skal være så lidt som muligt og helt dække larven, samtidig med at larven ikke er tør, når man rører vinylen.
- Tryk forsigtigt sondespidsen mod larven i segment A4 med et lystryk med spidsen i ca. 45° vinkel mellem sonden og larvens overflade (se figur 1). Trykket skal forårsage en lille indrykning på larvens overflade og vil normalt være tilstrækkeligt til at forhindre bevægelse. Hvis larven fortsætter med at bevæge sig, skal du anvende lidt mere tryk, og det vil normalt stoppe. Registrer ikke data fra larver, der bevæger sig ud over synsfeltet, eller for hvilke der ikke kan opnås konstant sondekontakt før respons eller 20 s cutoff.
- Fortsæt med at stimulere larven, indtil en tilbagetrækning svar er udstillet, eller indtil de 20 sekunder cutoff er nået, alt efter hvad der sker først. Reagerende larver viser typisk først en foreløbig opførsel ved at løfte hoved og hale. Dette efterfølges normalt af tilbagetrækningsadfærden ved at rulle mindst 360 grader. Kun en komplet rulle på 360 grader er scoret som nocifensive adfærd (den foreløbige hoved eller hale rejse er ikke).
- Når tilbagetrækning adfærd er indledt frigivelse kontakt med sonden og registrere latenstid eller tid til tilbagetrækning. Hvis der ikke observeres nogen tilbagetrækningsadfærd inden for 20 sekunder, er larven en ikke-responder. Respondenterne kan opdeles yderligere i 2 kategorier. Hvis tilbagetrækningsadfærden vises inden for 5 sekunder, er larven en hurtig responder. Hvis tilbagetrækningsadfærden vises mellem 5-20 sekunder, er larven en langsom responder (se figur 1 i Babcock et al., Curr. Biol. (2009)).
