Overview
ショウジョウバエ の幼虫は、潜在的に有害な熱刺激に対する反応が動物の回避的またはいわゆる「ノシフェンシブ」行動を引き起こす感覚ニューロン-ノシセプターを有する。このビデオでは、キューティクルへの熱プローブの局所的な適用に応じて幼虫の挙動を記録することによって熱切成を評価する方法について説明します。この方法は、したがって、局所熱プローブアッセイと呼ばれる。
Protocol
このプロトコルは、ショウジョウバエ・ラルヴェ、J.Vis. Expの熱性ノシセプションを評価するローカルおよびグローバルの方法であるChattopadhyayらからの抜粋です。(2012).
1. ローカルヒートプローブアッセイ
Pro-Devエンジニアリング製のカスタムメイドのサーマルプローブを使用して、個々の幼虫体セグメントに有害な熱刺激を提供します(材料表を参照)。このプローブは最適な設計機能(~07mm2の小さな金属チップと23°C~65°Cの設定点温度を正確に維持する機能)を備えていますが、原則として、最大20秒間、定義された温度まで加熱できる小さな先端を備えたツールで十分です。プローブ先端は、腹部セグメントA4の後頭中線で正確に3番目のインスター幼虫を正確に刺激するために使用される(図1を参照)。この熱刺激に対して、幼虫は一般的に360度以上横転する回避的な離脱行動を示す。この挙動は、一般的に彼らの運動活動の短い休止を伴う非有害な室温金属プローブに対する軽いタッチ応答とは異なります。
ヒートプローブアッセイのプロトコル:
- 熱プローブの温度を所望の設定点に事前設定した。
- ペイントブラシまたは鉗子を使用して、個々の幼虫を平らなプラットフォームに優しく移し(通常はバインダーから切り取った小片を使用します)、幼虫はその後刺激されます。幼虫は、熱プローブに接触する前に、水の薄膜で覆われるべきです。幼虫を覆う水のフィルムは、できるだけ少なく、幼虫に触れたときに幼虫が乾燥していないことを確認しながら、幼虫を完全に覆う必要があります。
- プローブと幼虫の表面との間の約45°の角度で先端に光圧を加えるセグメントA4の幼虫に対してプローブ先端を軽く押し付けます( 図1参照)。圧力は幼虫の表面にわずかなくぼみを引き起こす必要があり、通常は移動を防ぐのに十分です。幼虫が動き続ける場合は、少し圧力をかけ、通常は停止します。視野を越えて移動する幼虫や、応答または20 sのカットオフまで一定のプローブ接触を達成できない幼虫からのデータを記録しないでください。
- 引き出し応答が出るまで、または20秒のカットオフに達するまで、幼虫を刺激し続けます。反応する幼虫は、通常、最初に頭と尾を持ち上げる予備的な行動を示す。これは通常、少なくとも360度の転がりの撤退行動が続きます。360度の完全なロールだけが、cicifensive動作として採点されます(予備的な頭または尾の昇給はそうではありません)。
- 撤退動作が開始されると、プローブとの接触を解放し、待ち時間または撤退までの時間を記録します。20秒以内に離脱行動が観察されない場合、幼虫は非応答者である。応答側は、さらに 2 つのカテゴリに分類できます。撤退行動が5秒以内に示された場合、幼虫は速い応答者である。離脱行動が5〜20秒の間に示された場合、幼虫は遅い応答者である(Babcockら.、Currの図1を参照)。 バイオル。(2009)).
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Representative Results
図1:局所熱プローブアッセイ用に設定した実験。 熱プローブは、プローブの温度を設定し、維持するために使用される熱制御ユニットによって制御されます。プローブは後方軸に垂直に保持され、幼虫を水平に45°の角度で刺激するために使用されます。プローブ接触は、図示のように腹部セグメントA4で具体的に行われる。ユーザーは、20秒のカットオフまで、またはローリング動作が開始されるまで、穏やかな圧力でこの接触を維持する必要があります。温度が有害であると認識される場合、幼虫は少なくとも1つの360°ロールを特徴とする回避的な離脱行動を示す。ロールの数は、単一または複数にすることができます( 図 2Bを参照)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ヒートプローブアッセイを用いた行動応答の定量化。 (A) 各カテゴリに属する応答者の割合 (高速、低速、非応答者) と温度の比較。(B)上昇有害度(42°C、44°C、46°C、48°C、50°C、52°C)の4つの異なる試験温度で示された各幼虫のロール数に対する遅延の遅延のプロット。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermal Probe | Pro-Dev Engineering | Custom-built on demand | Contact information can be provided on request |
| Leica DFC290 12v/400mA Color camera | Leica Microsystems | 12730080 | Any equivalent camera will do. |
| Leica MZ6 microscope | Leica Microsystems | Part number for MZ6 zoom body (optics carrier) is 10445614 | |
| Schott Ace Modulamp Unit | Schott AG | A20500 | |
| Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide | Schott AG | Schott A08575 | |
| Thermal Control Unit | TSCI corp. | Custom Built | Details can be provided on request |
| Zeiss Stemi 2000 microscope | Carl Zeiss, Inc. | NT55-605 | Any equivalent microscope will do. |
| Forceps | Fine Science Tools | FS-1670 | |
| Paintbrush | Blick Art Materials | 06762-1002 | |
| 35 X 10 mm Polystyrene Petri Dish | Falcon BD | 351008 | We have not tested alternative dishes. |
| Piece of vinyl | Office Depot | 480009 |
