Ensayo local de sonda de calor: Un método para evaluar la nocicepción de altas temperaturas en larvas de Drosophila

Overview

Las larvas de Drosophila han dedicado neuronas sensoriales -nociceptores- cuya respuesta a estímulos térmicos potencialmente dañinos desencadena comportamientos aversivos -o los llamados "nocifensivos"- en el animal. Este video describe un método para evaluar la nocicepción térmica mediante el registro del comportamiento larvario en respuesta a la aplicación local de una sonda de calor en la cutícula. Este método se denomina, por lo tanto, el ensayo local de la sonda de calor.

Protocol

Este protocolo es un extracto de Chattopadhyay et al., Métodos locales y globales de evaluación de la nocicepción térmica en Larvas de Drosophila, J. Vis. Exp. (2012).

1. Ensayo local de sonda de calor

Entregamos un estímulo térmico nocivo a un segmento de cuerpo larvario individual utilizando una sonda térmica hecha a medida fabricada por Pro-Dev Engineering (ver Tabla de materiales). Aunque esta sonda tiene características de diseño óptimas (una pequeña punta metálica de ~ .07 mm² área y la capacidad de mantener con precisión una temperatura de punto de ajuste de 23 °C a 65 °C) en principio cualquier herramienta con una pequeña punta que se puede calentar a una temperatura definida durante un período de hasta 20 segundos debe ser suficiente. La punta de la sonda se utiliza para estimular las larvas tempranas de 3^rd instar precisamente en la línea media dorsal en el segmento abdominal A4 (ver Figura 1). En respuesta a este estímulo térmico, las larvas generalmente exhibirán un comportamiento de abstinencia aversiva de rodar lateralmente por 360 grados o más. Este comportamiento es distinto de su respuesta táctil ligera a una sonda metálica de temperatura ambiente no nociva que generalmente implica una breve pausa en su actividad de locomotoría.

Protocolo para el ensayo de sonda de calor:

1. Ajuste previamente la temperatura de la sonda térmica al punto de ajuste deseado.
2. Utilice un pincel o fórceps para transferir suavemente una larva individual a una plataforma plana (normalmente usamos un pequeño trozo de vinilo cortado de un aglutinante) en el que las larvas serán estimuladas posteriormente. La larva debe estar cubierta por una fina película de agua antes del contacto con la sonda térmica. La película de agua que cubre la larva debe ser lo menos posible y cubrir completamente la larva, a la vez que se asegura de que la larva no esté seca al tocar el vinilo.
3. Presione suavemente la punta de la sonda contra la larva en el segmento A4 aplicando presión de luz con la punta en aproximadamente un ángulo de 45° entre la sonda y la superficie de la larva (ver Figura 1). La presión debe causar una ligera sangría en la superficie de la larva y por lo general será suficiente para prevenir la locomoción. Si la larva continúa moviéndose, aplique un poco más de presión y por lo general se detendrá. No registre los datos de las larvas que se mueven más allá del campo de visión o para los que no se puede lograr el contacto constante de la sonda hasta la respuesta o el corte de 20 s.
4. Continúe estimulando la larva hasta que se exhiba una respuesta de abstinencia o hasta que se alcance el corte de 20 segundos, lo que ocurra primero. Las larvas que responden suelen mostrar primero un comportamiento preliminar de levantar la cabeza y la cola. Esto suele ir seguido por el comportamiento de abstinencia de rodar al menos 360 grados. Sólo un rollo completo de 360 grados se puntua como comportamiento nocifensivo (la cabeza preliminar o el aumento de la cola no lo es).
5. Una vez iniciado el comportamiento de retirada, el contacto de liberación con la sonda y registra la latencia o el tiempo de retirada. Si no se observa ningún comportamiento de abstinencia en 20 segundos, entonces la larva no responde. Los respondedores se pueden dividir aún más en 2 categorías. Si el comportamiento de abstinencia se muestra en 5 segundos, entonces la larva es un respondedor rápido. Si el comportamiento de abstinencia se muestra entre 5-20 segundos, entonces la larva es un respondedor lento (ver Figura 1 en Babcock et al., Curr. Biol. (2009)).

Representative Results

Figura 1: Configuración experimental para el ensayo de sonda de calor local. La sonda de calor está controlada por una unidad de control térmico que se utiliza para ajustar y mantener la temperatura de la sonda. La sonda se mantiene perpendicular al eje anteroposterior y se utiliza para estimular la larva en un ángulo de 45° a la horizontal. El contacto de la sonda se realiza específicamente en el segmento abdominal A4 como se muestra. El usuario debe mantener este contacto con presión suave hasta el corte de 20 segundos o hasta que comience el comportamiento de rodadura. Si la temperatura se percibe como nociva, la larva mostrará un comportamiento de abstinencia aversivo caracterizado por al menos un rollo de 360°. El número de rollos puede ser simple o múltiple (consulte la figura 2B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Cuantificación de la respuesta conductual mediante el ensayo de la sonda de calor. (A) Parcela del porcentaje de respondedores pertenecientes a cada categoría (rápidos, lentos y no respondedores) en comparación con la temperatura. (B) Parcela de la latencia al comportamiento de abstinencia aversiva en comparación con el número de rollos que cada larva exhibió a cuatro temperaturas de prueba diferentes de nocividad creciente (42 °C, 44 °C, 46 °C, 48 °C, 50 °C y 52 °C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thermal Probe	Pro-Dev Engineering	Custom-built on demand	Contact information can be provided on request
Leica DFC290 12v/400mA Color camera	Leica Microsystems	12730080	Any equivalent camera will do.
Leica MZ6 microscope	Leica Microsystems	Part number for MZ6 zoom body (optics carrier) is 10445614
Schott Ace Modulamp Unit	Schott AG	A20500
Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide	Schott AG	Schott A08575
Thermal Control Unit	TSCI corp.	Custom Built	Details can be provided on request
Zeiss Stemi 2000 microscope	Carl Zeiss, Inc.	NT55-605	Any equivalent microscope will do.
Forceps	Fine Science Tools	FS-1670
Paintbrush	Blick Art Materials	06762-1002
35 X 10 mm Polystyrene Petri Dish	Falcon BD	351008	We have not tested alternative dishes.
Piece of vinyl	Office Depot	480009