Detta protokoll är ett utdrag från Chattopadhyay et al., Lokala och globala metoder för att bedöma termisk nociception i Drosophila Larver, J. Vis. Exp. (2012).
1. Lokal värmesondsanalys
Vi levererar en skadlig termisk stimulans till ett enskilt larvkroppssegment med hjälp av en specialbyggd termisk sond tillverkad av Pro-Dev Engineering (se Materialförteckning). Även om denna sond har optimala konstruktionsfunktioner (en liten metallspets på ~ .07 mm2-område och förmågan att exakt upprätthålla en börpunktstemperatur från 23 °C till 65 °C) bör i princip alla verktyg med en liten spets som kan värmas upp till en definierad temperatur under en period av upp till 20 sekunder räcka. Sondspetsen används för att stimulera tidiga 3rd instar larver exakt på den dorsala mittlinjen vid buksegment A4 (se figur 1). Som svar på denna termiska stimulans kommer larver i allmänhet att uppvisa ett aversivt abstinensbeteende att rulla i 360 grader eller mer. Detta beteende skiljer sig från deras lätta beröringssvar på en icke-skadlig rumstemperaturmetallsond som i allmänhet innebär en kort paus i deras lokomotoriska aktivitet.
Protokoll för värmesondsanalysen:
- Förinställningstemperatur för termisk sond till önskad bördpunkt.
- Använd en pensel eller tång för att försiktigt överföra en enskild larva till en platt plattform (vi använder vanligtvis en liten bit vinyl skuren från ett bindemedel) där larverna därefter stimuleras. Larven ska täckas av en tunn vattenfilm före kontakt med värmesonden. Vattenfilmen som täcker larven ska vara så liten som möjligt och helt täcka larven, samtidigt som larven inte är torr när du rör vinylen.
- Tryck försiktigt sondspetsen mot larven vid segment A4 och applicera lätt tryck med spetsen i ca 45° vinkel mellan sonden och larvens yta (se figur 1). Trycket bör orsaka en liten fördjupning på larvens yta och kommer vanligtvis att vara tillräckligt för att förhindra rörelse. Om larven fortsätter att röra sig, applicera något mer tryck och det kommer vanligtvis att sluta. Registrera inte data från larver som rör sig utanför synfältet eller för vilka konstant sondkontakt inte kan uppnås förrän svar eller 20 s cutoff.
- Fortsätt att stimulera larven tills ett abstinenssvar ställs ut eller tills den 20 sekunder långa brytningen uppnås, beroende på vad som inträffar först. Svarande larver visar vanligtvis först ett preliminärt beteende att lyfta huvud och svans. Detta följs vanligtvis av abstinensbeteendet att rulla minst 360 grader. Endast en komplett rulle på 360 grader poängsätts som nocifensivt beteende (den preliminära huvud- eller svanshöjningen är inte).
- När abstinens beteendet har initierats släpp kontakt med avsökningen och registrera svars tiden eller tiden till uttag. Om inget abstinensbeteende observeras inom 20 sekunder är larven en icke-responder. De svarande kan delas in ytterligare i två kategorier. Om abstinensbeteendet visas inom 5 sekunder är larven en snabbsvarare. Om abstinensbeteendet visas mellan 5-20 sekunder är larven en långsam responder (se figur 1 i Babcock et al., Curr. Biol, det är jag. (2009)).
