Lokal värmesondsanalys: En metod för att bedöma nociception av höga temperaturer i Drosophila Larver

Overview

Drosophila larver har dedikerade sensoriska nervceller - nociceptorer - vars svar på potentiellt skadliga termiska stimuli utlöser aversiva - eller så kallade "nocifensiva" - beteenden hos djuret. Denna video beskriver en metod för att bedöma termisk nociception genom att registrera larv beteende som svar på lokala tillämpningen av en värme sond på nagelband. Denna metod kallas därför den lokala värmesondsanalysen.

Protocol

Detta protokoll är ett utdrag från Chattopadhyay et al., Lokala och globala metoder för att bedöma termisk nociception i Drosophila Larver, J. Vis. Exp. (2012).

1. Lokal värmesondsanalys

Vi levererar en skadlig termisk stimulans till ett enskilt larvkroppssegment med hjälp av en specialbyggd termisk sond tillverkad av Pro-Dev Engineering (se Materialförteckning). Även om denna sond har optimala konstruktionsfunktioner (en liten metallspets på ~ .07 mm^2-område och förmågan att exakt upprätthålla en börpunktstemperatur från 23 °C till 65 °C) bör i princip alla verktyg med en liten spets som kan värmas upp till en definierad temperatur under en period av upp till 20 sekunder räcka. Sondspetsen används för att stimulera tidiga 3^rd instar larver exakt på den dorsala mittlinjen vid buksegment A4 (se figur 1). Som svar på denna termiska stimulans kommer larver i allmänhet att uppvisa ett aversivt abstinensbeteende att rulla i 360 grader eller mer. Detta beteende skiljer sig från deras lätta beröringssvar på en icke-skadlig rumstemperaturmetallsond som i allmänhet innebär en kort paus i deras lokomotoriska aktivitet.

Protokoll för värmesondsanalysen:

1. Förinställningstemperatur för termisk sond till önskad bördpunkt.
2. Använd en pensel eller tång för att försiktigt överföra en enskild larva till en platt plattform (vi använder vanligtvis en liten bit vinyl skuren från ett bindemedel) där larverna därefter stimuleras. Larven ska täckas av en tunn vattenfilm före kontakt med värmesonden. Vattenfilmen som täcker larven ska vara så liten som möjligt och helt täcka larven, samtidigt som larven inte är torr när du rör vinylen.
3. Tryck försiktigt sondspetsen mot larven vid segment A4 och applicera lätt tryck med spetsen i ca 45° vinkel mellan sonden och larvens yta (se figur 1). Trycket bör orsaka en liten fördjupning på larvens yta och kommer vanligtvis att vara tillräckligt för att förhindra rörelse. Om larven fortsätter att röra sig, applicera något mer tryck och det kommer vanligtvis att sluta. Registrera inte data från larver som rör sig utanför synfältet eller för vilka konstant sondkontakt inte kan uppnås förrän svar eller 20 s cutoff.
4. Fortsätt att stimulera larven tills ett abstinenssvar ställs ut eller tills den 20 sekunder långa brytningen uppnås, beroende på vad som inträffar först. Svarande larver visar vanligtvis först ett preliminärt beteende att lyfta huvud och svans. Detta följs vanligtvis av abstinensbeteendet att rulla minst 360 grader. Endast en komplett rulle på 360 grader poängsätts som nocifensivt beteende (den preliminära huvud- eller svanshöjningen är inte).
5. När abstinens beteendet har initierats släpp kontakt med avsökningen och registrera svars tiden eller tiden till uttag. Om inget abstinensbeteende observeras inom 20 sekunder är larven en icke-responder. De svarande kan delas in ytterligare i två kategorier. Om abstinensbeteendet visas inom 5 sekunder är larven en snabbsvarare. Om abstinensbeteendet visas mellan 5-20 sekunder är larven en långsam responder (se figur 1 i Babcock et al., Curr. Biol, det är jag. (2009)).

Representative Results

Figur 1: Experimentell uppsättning för lokal värmesondsanalys. Värmesonden styrs av en termisk styrenhet som används för att ställa in och bibehålla sondens temperatur. Sonden hålls vinkelrät mot anteroposterioraxeln och används för att stimulera larven i en vinkel på 45° mot horisontalplanet. Sondkontakt görs specifikt vid buksegment A4 som visas. Användaren måste upprätthålla denna kontakt med skonsamt tryck fram till 20 sekunders avstängning eller tills rullbeteendet börjar. Om temperaturen uppfattas som skadlig, kommer larven att visa ett aversivt abstinensbeteende som kännetecknas av minst en 360 ° rulle. Antalet rullar kan vara enstaka eller flera (se figur 2B). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 2: Kvantifiering av beteendemässiga reaktioner med hjälp av värmesondsanalysen. (A) Diagram över procent av de svarande som tillhör varje kategori (snabb-, långsam- och icke-svarande) jämfört med temperatur. b) Latencyensutfall för aversivt abstinensbeteende jämfört med antalet rullar som varje larv uppvisade vid fyra olika testtemperaturer med ökande skadlighet (42 °C, 44 °C, 46 °C, 48 °C, 50 °C och 52 °C). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thermal Probe	Pro-Dev Engineering	Custom-built on demand	Contact information can be provided on request
Leica DFC290 12v/400mA Color camera	Leica Microsystems	12730080	Any equivalent camera will do.
Leica MZ6 microscope	Leica Microsystems	Part number for MZ6 zoom body (optics carrier) is 10445614
Schott Ace Modulamp Unit	Schott AG	A20500
Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide	Schott AG	Schott A08575
Thermal Control Unit	TSCI corp.	Custom Built	Details can be provided on request
Zeiss Stemi 2000 microscope	Carl Zeiss, Inc.	NT55-605	Any equivalent microscope will do.
Forceps	Fine Science Tools	FS-1670
Paintbrush	Blick Art Materials	06762-1002
35 X 10 mm Polystyrene Petri Dish	Falcon BD	351008	We have not tested alternative dishes.
Piece of vinyl	Office Depot	480009