Voorbereiding van Drosophila Heart: een techniek om hartfysiologie in de volwassen vlieg te bestuderen

Overview

Deze video beschrijft het volwassen hart van de vlieg, of anders het Drosophila dorsale vat genoemd. Het aanbevolen protocol demonstreert een dissectieprocedure voor levende hartpreparaten.

Protocol

Dit protocol is een fragment uit Vogler en Ocorr, Visualizing the Beating Heart in Drosophila, J. Vis. Exp. (2009).

1. Voordat je begint

1. Bereid vers kunstmatige hemolymph (AH) oplossing met 108mM Na⁺, 5mM K +, 2mM Ca^{2 +}, 8mM MgCl_2,1mM NaH₂PO_4,4mM NaHCO_3,10mM sucrose, 5mM trehalose, 5mM HEPES (pH 7.1, alle reagentia van Sigma Chemicals). De sacharose en trehalose moeten vlak voor gebruik uit gekoelde voorraadoplossingen aan de AH worden toegevoegd om bacteriële besmetting te voorkomen.
2. Breng AH op kamertemperatuur en zuurstof geef de oplossing zuurstof door minstens 15 minuten aan de lucht te borrelen.
3. Trek aan verschillende fijne haarvaten (bijv. glazen haarvaten, 100ul, VWR) die nodig zijn voor het verwijderen van vet.

2. Semi-intact Drosophila Heart van de Adult Fly

1. Volwassen Drosophila vliegen worden verdoofd met Fly Nap (Carolina Biological Supply Co.) gedurende 2-5 minuten. Zorg ervoor dat de vliegen niet langer in de Fly Nap blijven. Blootstelling op korte termijn aan kou kan ook worden gebruikt om vliegen te verdoven, maar CO₂ wordt niet aanbevolen omdat het langdurigere effecten heeft op de hartslag en ritmiek.
2. Verdoofde vliegen worden, dorsale kant naar beneden, in een Petrischaal geplaatst die is bedekt met een dun laagje vaseline. De hydrofobe cutic in de vleugels en het lichaam "plakken" omkeerbaar aan de gelei, maar de vlieg kan indien nodig worden verplaatst. Dit wordt vooral belangrijk tijdens latere manipulaties.
3. Een eerste snede wordt gemaakt met behulp van een gebogen veerschaar (Roboz #5611). De schaarbladen worden onder de poten geplaatst en naar beneden gehoekt in de richting van het dorsale oppervlak van de thorax in de buurt van de nek. Het hoofd, het ventrale zenuwkoord en de benen worden met een enkele snede verwijderd. Het preparaat wordt vervolgens ondergedompeld in een zuurstofrijke, kunstmatige hemolymph (AH) oplossing.
4. Met behulp van een veerschaar wordt de achterste punt van de buik (bestaande uit buiksegmenten 7 en 8) verwijderd met een enkele snede. Dit biedt toegang voor het maken van laterale sneden langs beide randen van de buik en dient om de verbinding tussen de achterste darm en de buiksniula te verbreken. De vrijgesneden klep van de ventrale buikspier wordt vervolgens verwijderd.
5. In stap 3 en 4 worden de voorste en achterste verbindingen van de darm doorgesneden, zodat de buikorganen nu alleen door luchtpijpen op hun plaats worden gehouden. De darm en andere buikorganen kunnen meestal als een enkele massa worden verwijderd met behulp van juweliers tang (Roboz, #55) en zacht trekken. Het verwijderen van de interne organen onthult de kloppende hartbuis die nog steeds is bevestigd aan de dorsale cuticula omringd door dikke lichamen.
6. De vetlichamen zijn vrij ondoorzichtig in de lichtmicroscoop, daarom is het vaak nodig om een deel van dit vet te verwijderen om de hartbuis duidelijk te zien. Dit wordt bereikt door een liposuctietechniek met behulp van fijngetrokken glazen haarvaten. Haarvaten worden gemaakt met behulp van een standaard pipettrekker (bijv. Sutter P-97 Pipet Puller) en worden vervolgens in plastic buizen (Tygon, 1/16") geplaatst die aan een vacuümbron zijn bevestigd. Dit systeem wordt gebruikt om overtollig vet van rond de hartbuis af te zuigen. De zuigkracht is evenredig met de tipdiameter, dus pipetten met uiteinden met een diameter van meer dan 40 micron mogen niet worden gebruikt. Er moet uiterst voorzichtig worden om te voorkomen dat het hart zelf wordt aangeraakt en omdat het achterste deel van het hart erg kwetsbaar is, moet dat gebied helemaal worden vermeden.
7. De volwassen Drosophila hartbuis is nu blootgesteld en zou moeten kloppen. Indien nodig kunnen de nagelriem en het aangehechte hart worden verplaatst door de nagelriem voorzichtig uit de vaseline te tillen en voorzichtig terug te te stampen, waarbij opnieuw elk contact met het hartweefsel wordt vermeden. Op dit punt moet de oplossing voor het baden van het preparaat worden vervangen door verse AHL. Dit preparaat moet gedurende 20-30 minuten met oxygenatie kunnen worden geïlibreerd voordat er manipulaties worden uitgedreven. Als het preparaat langer dan 60 minuten moet worden bewaard, moet het worden doordrenkt met verse AHL.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro Dissecting Spring Scissors (curved)	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5611	Good for gross cuts (Step 2)
Micro Dissecting Spring Scissors (straight)	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5620
Dumont #55 forceps	Fine Science Tools	11295-51
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11295-10
Glass Capillaries, fine	Science Products	GB100T8P
Pipette Puller	Sutter Equipment	P-97	Both horizontal and vertical pipette pullers will work
Plastic tubing	Tygon	1/16" inner diameter	for 100 µl capillaries
Histoacryl® tissue adhesive	B. Braun Medical