הכנת לב דרוזופילה: טכניקה לחקר פיזיולוגיית הלב בזבוב הבוגר

Overview

סרטון זה מתאר את הלב הבוגר של הזבוב, או נקרא בדרך אחרת כלי הגב של דרוזופילה. הפרוטוקול המוצג מדגים הליך ניתוח להכנות לב חי.

Protocol

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך ווגלר ו Ocorr, לדמיין את הלב הפועם ב Drosophila, J. Vis. Exp. (2009).

1. לפני שאתה מתחיל

1. פתרון hemolymph מלאכותי (AH) טרי המכיל 108mM Na⁺, 5mM K +, 2mM Ca²⁺, 8mM MgCl₂, 1mM NaH₂PO₄, 4mM NaHCO₃, 10mM סוכרוז, 5m trehalose, 5m HEPES (pH 7.1, כל ריאגנטים מ כימיקלים סיגמא). יש להוסיף את סוכרוז וטרהלוז ל- AH מפתרונות מלאי בקירור ממש לפני השימוש על מנת למנוע זיהום חיידקי.
2. הביאו את AH לטמפרטורת החדר וחמצןו את הפתרון על ידי מבעבע אוויר לפחות 15 דקות.
3. משוך כמה נימים עדינים (למשל נימי זכוכית, 100ul, VWR) הנדרש להסרת שומן.

2. לב דרוזופילה שלם למחצה מהטיסה הבוגרת

1. זבובי דרוזופילה בוגרים מורדמים עם Fly Nap (קרולינה ביולוגית אספקה ושות') למשך 2-5 דקות. יש להקפיד לא להשאיר את הזבובים בתנומת הזבוב לחשיפות ארוכות יותר. חשיפה לטווח קצר לקור יכולה לשמש גם כדי להרעין זבובים אבל CO₂ לא מומלץ כפי שיש לו השפעות ארוכות טווח על קצב הלב וקצביות.
2. זבובים מורדמים ממוקמים, צד הגב למטה, לתוך צלחת פטרי מצופה שכבה דקה של ג'לי נפט. הקוטיקל ההידרופובי בכנפיים ובגוף "נדבק" לג'לי באופן הפיך, אך ניתן למקם מחדש את הזבוב במידת הצורך. זה הופך להיות חשוב במיוחד במהלך המניפולציות הבאות.
3. חיתוך ראשוני נעשה באמצעות זוג מעוקל של מספריים קפיץ (Roboz #5611). להבי המספריים ממוקמים מתחת לרגליים וזווית כלפי מטה לכיוון פני השטח הגביים של בית החזה ליד הצוואר. הראש, חוט העצבים הגחוני והרגליים מוסרים בחתך אחד. לאחר מכן ההכנה שקועה בתמיסת המולמה מלאכותית מחומצנת (AH).
4. באמצעות מספריים באביב הקצה האחורי של הבטן (מורכב מקטעי בטן 7 ו 8) מוסר עם חתך אחד. זה מספק גישה להכנת חתכים לרוחב לאורך שני הקצוות של הבטן ומשמש לנתק את הקשר בין הבטן האחורית לבין קוטיקולה הבטן. הדש המשוחרר של קוטיקל בטן הגחוני מוסר לאחר מכן.
5. בשלבים 3 ו -4 הקשרים האחוריים והאחוריים של המעיים נקטרים ולכן איברי הבטן מוחזקים כעת במקום רק על ידי קנה הנשימה. הבטן ואיברי בטן אחרים בדרך כלל ניתן להסיר כמו מסה אחת באמצעות מלקחיים של תכשיטן (Roboz, #55) ומשיכה עדינה. הסרת האיברים הפנימיים חושפת את צינור הלב הפועם שעדיין מחובר לתיק הגב המוקף בגופי שומן.
6. גופי השומן הם אטומים למדי במיקרוסקופ האור וכתוצאה מכך לעתים קרובות יש צורך להסיר חלק מהשומן הזה כדי לראות את צינור הלב בבירור. זה מושג על ידי טכניקת שאיבת שומן באמצעות נימי זכוכית מצוירים דק. נימים מיוצרים באמצעות מושך פיפטה סטנדרטי (למשל סאטר P-97 פיפט פולר) ולאחר מכן מוכנסים לתוך צינורות פלסטיק (Tygon, 1/16") מחובר למקור ואקום. מערכת זו משמשת ליניקה של שומן עודף מרחבי צינור הלב. כוח היניקה הוא פרופורציונלי לקוטר קצה כך פיפטות עם טיפים גדולים מ 40 מיקרון קוטר לא צריך לשמש. יש לנקוט משנה זהירות כדי להימנע מנגיעה בלב עצמו ומכיוון שהחלק האחורי של הלב שברירי מאוד שיש להימנע ממנו לחלוטין.
7. שפופרת הלב הבוגרת של דרוסופילה חשופה כעת וצריכה לפעום. במידת הצורך, ניתן למקם מחדש את הקוטיקל והלב המצורף על ידי הרמת הקוטיקל בעדינות מתוך ג'לי הנפט ולאלף אותו בזהירות בחזרה למטה, שוב הימנעות מכל מגע עם רקמת הלב. בשלב זה הפתרון רחצה ההכנה צריכה להיות מוחלפת עם AHL טרי. הכנה זו צריכה להיות מותרת לשוויון במשך 20-30 דקות עם חמצון לפני כל מניפולציות. אם ההכנה היא להישמר במשך יותר מ 60 דקות זה צריך להיות perfused עם AHL טרי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro Dissecting Spring Scissors (curved)	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5611	Good for gross cuts (Step 2)
Micro Dissecting Spring Scissors (straight)	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5620
Dumont #55 forceps	Fine Science Tools	11295-51
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11295-10
Glass Capillaries, fine	Science Products	GB100T8P
Pipette Puller	Sutter Equipment	P-97	Both horizontal and vertical pipette pullers will work
Plastic tubing	Tygon	1/16" inner diameter	for 100 µl capillaries
Histoacryl® tissue adhesive	B. Braun Medical