Drosophila Kalbinin Hazırlanması: Yetişkin Sineği'nde Kalp Fizyolojisini İnceleme Tekniği

Overview

Bu video, sineğin yetişkin kalbini veya başka bir şekilde Drosophila sırt damarını tanımlar. Öne çıkan protokol, canlı kalp preparatları için bir diseksiyon prosedürü göstermektedir.

Protocol

Bu protokol Vogler ve Ocorr'dan bir alıntıdır, Drosophila'dakiAtan Kalbi Görselleştirir,J. Vis. Exp. (2009). 

1. Başlamadan önce

1. 108mM Na + , 5mM K⁺içeren yapay hemolimf (AH) çözeltisini taze hazırlayın, 2mM Ca²⁺, 8mM MgCl₂, 1mM NaH₂PO₄, 4mM NaHCO₃, 10mM sakkaroz, 5mM trehaloz, 5m HEPES (pH 7.1, Sigma Kimyasallarından tüm reaktifler). Sakkaroz ve trehaloz, bakteriyel kontaminasyonu önlemek için kullanımdan hemen önce soğutulmuş stok çözeltilerinden AH'ye eklenmelidir.
2. AH'yi oda sıcaklığına getirin ve çözeltiyi en az 15 dakika hava köpürterek oksijenlendirmek.
3. Yağın uzaklaştırılması için gerekli olan birkaç ince kılcal damarı (örneğin Cam Kılcal Damarlar, 100ul, VWR) çekin.

2. Yetişkin Sinek yarı bozulmamış Drosophila Kalp

1. Yetişkin Drosophila sinekleri 2-5 dakika boyunca Fly Nap (Carolina Biological Supply Co.) ile uyuşturulur. Daha uzun maruz kalmalar için sinekleri Sinek Uykusu'nda bırakmamaya özen göstermelisiniz. Soğuğa kısa süreli maruz kalma sinekleri uyuşturmak için de kullanılabilir, ancak kalp atış hızı ve ritmiklik üzerinde daha uzun süreli etkileri olduğu için CO₂ önerilmez.
2. Uyuşturulmuş sinekler, dorsal tarafı aşağı, ince bir petrol jeli tabakası ile kaplanmış bir Petri kabına yerleştirilir. Kanatlardaki ve vücuttaki hidrofobik kütikül, jöleye geri dönüşümlü olarak "yapışır", ancak gerekirse sinek yeniden konumlandırılabilir. Bu, sonraki manipülasyonlar sırasında özellikle önemli hale gelir.
3. kavisli bir yay makası (Roboz #5611) kullanılarak ilk kesim yapılır. Makas bıçakları bacakların altına yerleştirilir ve boyun yakınındaki toraksın sırt yüzeyine doğru açılır. Baş, ventral sinir kordonu ve bacaklar tek bir kesikle çıkarılır. Preparat daha sonra oksijenli, yapay hemolimf (AH) çözeltiye batırılır.
4. Yay makası kullanılarak karın arka ucu (7 ve 8 karın segmentlerinden oluşur) tek bir kesikle çıkarılır. Bu, karnın her iki kenarı boyunca yanal kesikler yapmak için erişim sağlar ve arka bağırsak ile karın lütikül arasındaki bağlantıyı kesmeye yarar. Ventral abdominal kütikül serbest kapak daha sonra çıkarılır.
5. 3. ve 4. adımlarda bağırsağın ön ve arka bağlantıları kopmuş, böylece karın organları artık sadece trakeoller tarafından yerinde tutulmaktadır. Bağırsak ve diğer karın organları genellikle kuyumcu asarı (Roboz, #55) ve hafif çekme kullanılarak tek bir kütle olarak çıkarılabilir. İç organların çıkarılması, hala yağ cisimleri ile çevrili sırt maniköke bağlı atan kalp tüpünü ortaya çıkarır.
6. Yağ gövdeleri ışık mikroskopunda oldukça opaktır, bu nedenle kalp tüpünü net bir şekilde görmek için genellikle bu yağın bir kısmını çıkarmak gerekir. Bu, ince çizilmiş cam kılcal damarlar kullanılarak bir liposuction tekniği ile gerçekleştirilir. Kılcal damarlar standart bir pipet çekeceği (örneğin Sutter P-97 Pipet Çekeceği) kullanılarak yapılır ve daha sonra vakum kaynağına bağlı plastik borulara (Tygon, 1/16") yerleştirilir. Bu sistem, kalp tüpünün etrafındaki fazla yağları emmek için kullanılır. Emiş kuvveti uç çapı ile orantılıdır, bu nedenle çapı 40 mikrondan büyük uçlu pipetler kullanılmamalıdır. Kalbin kendisine dokunmamak için aşırı özen göstermeli ve kalbin arka kısmı çok kırılgan olduğu için o bölgeden tamamen kaçınılmalıdır.
7. Yetişkin Drosophila kalp tüpü şimdi maruz kaldı ve atıyor olmalı. Gerekirse, kütikül ve bağlı kalp, kütikül petrol jölesinin içinden hafifçe kaldırılarak ve dikkatlice geri evcilleştirilerek yeniden konumlandırılabilir ve yine kalp dokusuyla herhangi bir temastan kaçınılabilir. Bu noktada çözelti banyo preparat taze AHL ile değiştirilmelidir. Bu preparat, herhangi bir manipülasyondan önce oksijenlenme ile 20-30 dakika boyunca dengelenmesine izin verilmelidir. Hazırlık 60 dakikadan uzun süre korunacaksa taze AHL ile perfüzyon yapılmalıdır.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro Dissecting Spring Scissors (curved)	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5611	Good for gross cuts (Step 2)
Micro Dissecting Spring Scissors (straight)	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5620
Dumont #55 forceps	Fine Science Tools	11295-51
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11295-10
Glass Capillaries, fine	Science Products	GB100T8P
Pipette Puller	Sutter Equipment	P-97	Both horizontal and vertical pipette pullers will work
Plastic tubing	Tygon	1/16" inner diameter	for 100 µl capillaries
Histoacryl® tissue adhesive	B. Braun Medical