C. Elegans Chemotaxis Assay: En metode til at teste chemosensation i orme

Overview

Denne video introducerer chemotaxis i nematode C. elegans og viser en prøve protokol test kemotaktisk aversion mod kobber sulfat.

Protocol

Følgende protokol er et uddrag fra Campbell et al., A Caenorhabditis elegans Nutritional-Status Based Copper Aversion Assay, J. Vis. Exp. (2017).

1. Forberedelse af forsøgsorganismer
   1. Pick 10 L4 iscenesatte nematoder pr stamme 24 timer før påbegyndelse af analysen for at sikre, at organismer er unge voksne, når testet. For hver mutant eller kontrol nematode testet, pick 10 L4s (10 for kontrol og 10 for analysen).
      1. Hold L4 organismer ved hjælp af standardmetoder i 24 timer på standard agarplader seedet med OP50 Escherichia coli. Hvis organismer går tabt under de efterfølgende vasketrin, skal du kompensere ved at øge startprøvestørrelsen(dvs. plukke 20 orme i stedet for 10).
         BEMÆRK: Adfærd er en medfødt variabel fænotype. Udfør metoden i tre eksemplarer for hver belastning på tre separate dage. Medtag yderligere kontrolstammer og betingelser for nye stammer, som fremhævet i diskussionsafsnittet.
   2. Umiddelbart før analysen overføres eksperimentelle organismer til en agarplade uden bakterier, og nematoder kan bevæge sig frit i 1 min. for at fjerne overskydende bakterier.
      1. Hvis forsøgsorganismer oplevede kontamineringsforhold i løbet af de 24 timer før analysen, skal de kasseres.
   3. Pipette 1 mL M9 på den bakteriefri plade for at vaske orme i et mikrocentrifugerør.
   4. Centrifuge ved 3.000 x g i 1 min. Orme skal danne en pellet i bunden af røret. Aspirat M9 opløsning uden at forstyrre ormen pellet. Tilsæt 1 ml M9 til ormen pellet, invertere rør til at blande orme med opløsningen.
   5. Gentag trin 1.4 tre gange mere.
      1. Hvis overskydende bakterier oprindeligt blev overført med ormene, gentag i alt 5 gange. Ingen bakterier bør overføres til kobber mad race plader. Hvis fødevarer overføres til analysepladen, vil det forstyrre nøjagtig dataindsamling.
   6. Efter den endelige vask forbliver aspirat supernatant indtil 100 μL M9 og ormepillen.
      Advarsel: Sult relateret adfærd bliver tydeligt efter 30 min. Derfor bør orme straks overføres fra opløsningen, når vasketrinnene er afsluttet.
2. Fremstilling af assayplader
   1. Forbered standard NGM agar plader to dage før analysen.
      1. Hvis plader opbevares i fugtige omgivelser, skal du lave agarplader 3 dage før analysen. Alternativt kan du fjerne låget på pladen i 3 - 6 timer for at sikre korrekt tørhed (hvis i et sterilt miljø).
   2. Med en tyk permanent markør skal du lave en linje på undersiden af pladen langs yderkanten og en anden for at danne en midterlinjebarriere (Figur 1). Midterlinjens barriere skal være lige langt fra hver kant af pladen. Brug en lineal til at sikre præcise målinger. Disse linjer vil tjene som en guide, når du overfører bakterier og kobberopløsningen. Forudsat at E. coli overføres før kobberopløsningen, vil disse linjer tjene som indikatorer.
   3. Frøplade med 50 μL OP50 E. coli på kun den ene side af kobberbarrieren for at skabe en ensartet græsplæne (figur 2). Bakteriekoncentrationen bør forblive konsistent på tværs af assays; der er dog kun observeret ringe variation som reaktion på milde forskelle i koncentrationen.
      1. Brug de afmærkede linjer på undersiden af pladen for at sikre, at bakterierne ikke kommer i kontakt med kobberopløsningen. Forudsat at kobberopløsningen linjer kanten af pladen og danner en midterlinjebarriere, overføres bakterierne, så kobberopløsningen ikke kommer i kontakt med fødekilden.
   4. Marker et andet sæt plader, og overfør ingen OP50 E. coli til dem (figur 2). Disse plader vil tjene til at evaluere den negative kontrol. Disse plader bør også være mærket på den ene halvdel af pladen for at angive den oprindelige overførselsoprindelse.
   5. Lad bakterierne tørre og inkuber derefter plader ved 37 °C natten over. Sørg for, at bakterieplastre ikke forstyrres, når de overføres til en 37 °C inkubator eller et rum. Overdreven forstyrrelse kan ændre placeringen eller formen af madpletten.
3. Chemotaxis Assay
   1. Forbered frisk en 0,5 M kobber (II) sulfatopløsning inden analysens starttidspunkt. Forudsat at der anvendes 125 μL af opløsningen pr. plade, skaleres dette volumen op afhængigt af antallet af anvendte assayplader(f.eks. 5 assayplader, 625 μL).
   2. Pipette 100 μL af kobber (II) sulfatopløsningen på kanten af agaren for at skabe en ydre kobberbarriere. Den markerede underside af pladen skal tjene som guide.
   3. Pipetter 25 μL af kobbersulfatopløsningen (II) for at skabe en midterlinjebarriere.
      1. Sørg for, at kobbersulfatopløsningen (II) ikke kommer i kontakt med bakterieplastret. Brug en plettet teknik som striber kan påvirke bevægelse på grund af fordybninger / ridser på agaren.
   4. Lad kobberopløsningen tørre på pladen. Tidsperioden kan variere afhængigt af plade- og laboratorieforhold. Kontroller visuelt for tørhed hvert 5. minut efter overførslen.
      BEMÆRK: Kobberopløsningen viser en blålig farvetone og er let identificerbar. Brug et laboratorievæv til let at duppe opløsningen nær kanten af pladen for at skelne tørhed.
   5. Pipette 20 μL af ormen pellet fra bunden af røret på den bakteriefri halvdel af analysen plade.
      1. Sørg for, at 10 orme overføres til analysepladen. Hvis ekstra orme ved et uheld blev inkluderet, skal du fjerne dem ved at plukke med halocarbonolie for at sikre, at der ikke tilsættes bakterier til pladen. Hver analyse skal have et konsistent antal nematoder under analysen.
         BEMÆRK: Hvis der overføres for få orme under assays, vil en forøgelse af den oprindelige prøvestørrelse mindske potentielle tab under vask og overførsler.
   6. Fjern overskydende M9 fra pladen med et laboratorievæv. M9 må ikke komme i kontakt med kobbersulfatopløsningen (II).
      Forsigtig: Sørg for, at ormene og agaroverfladen forbliver upåvirket, mens du udfører dette trin. Hvis det bruges for hårdt, kan laboratorievævet skabe fordybninger til pladens agaroverflade og kan fjerne orme. Orme, der ved et uheld fjernes via KimWipe, skal kasseres.
   7. Når M9-opløsningen er fjernet, og alle orme er påbegyndt ikke-flydende lokomotoriske mønstre, skal du starte analysens stopur.
      1. Fjern M9-opløsningen optimalt inden for et minut. Den væsentlige parameter er identifikationen af sinusoidal bevægelse. Orme locomote anderledes, fx prygl snarere end sinusformet, når i væske. Start analysen stop se, når hver af de eksperimentelle organismer stopper prygl.
   8. Tjek assay plader hver 30 min.
      1. For assay plader med bakterielle pletter, positivt score organismer, hvis de når mad plaster over en 4 timers periode. For de negative kontrolplader, positivt score organismer, hvis de har krydset barrieren.

Representative Results

Figur 1: En visuel repræsentation af markeringer for at angive placering af kobberopløsning på undersiden af en 5 cm petriskål. Disse indikationer anvendes til at sikre, at pladernes sektioner er blevet korrekt målt og tjener som retningslinje ved overførsel af bakterieplastret og derefter kobberopløsningen på agaroverfladen.

Figur 2: Den 5 cm petriskål er opdelt i to sektioner til til og fra Madanalyseplader, og der dannes en bakteriel græsplæne i midten af en af disse sektioner til onfoodpladen. Madpletten må ikke komme i kontakt med prøveblandingen, som linjer kanterne af pladen og danner en midterlinjebarriere.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.]			Produced in lab
Cupric Sulfate	Sigma	C-1297	Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M