К. Элеганс Chemotaxis Assay: Метод проверки химиосенсации у червей

Overview

Это видео вводит хемотаксис в нематод C. elegans и показывает образец протокола тестирования хемотаксического отвращения к сульфату меди.

Protocol

Следующий протокол является выдержка из Кэмпбелл и др., Caenorhabditis elegans Пищевые статус основе медных отвращение Анализа, J. Vis. Exp. (2017).

1. Подготовка экспериментальных организмов
   1. Выберите 10 L4 поставил нематод на штамм 24 ч до начала анализа, чтобы убедиться, что организмы молодых людей при тестировании. Для каждого мутанта или контроля нематод испытания, выбрать 10 L4s (10 для управления и 10 для анализа).
      1. Поддержание L4 организмов с использованием стандартных методов для 24 ч на стандартных пластин агара посеяны с OP50 Escherichia coli. Если организмы теряются во время последующих шагов мытья, компенсировать за счет увеличения размера стартового образца(т.е. выбрать 20 червей, а не 10).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Поведение является врожденно переменным фенотипом. Выполните метод в три раза для каждой нагрузки на три отдельных дня. Включите дополнительные контрольные нагрузки и условия для новых штаммов, как подчеркивается в разделе обсуждения.
   2. Непосредственно перед анализом, передача экспериментальных организмов на агар пластины без бактерий и позволяют нематод свободно перемещаться в течение 1 мин, чтобы удалить избыток бактерий.
      1. Если экспериментальные организмы испытывали условия загрязнения в течение 24 ч до анализа, отбросить их.
   3. Pipette 1 мл M9 на бактерий свободной пластины для мытья червей в микроцентрифуг трубки.
   4. Центрифуга по 3000 х г в течение 1 мин. Черви должны образовывать гранулы на дне трубки. Аспират M9 раствор, не нарушая червя гранулы. Добавьте 1 мл M9 в гранулы червя, инвертную трубку, чтобы смешать червей с раствором.
   5. Повторите шаги 1.4 еще три раза.
      1. Если избыток бактерий изначально передавались с червями, повторите в общей сложности 5 раз. Никакие бактерии не должны быть перенесены на медные пластины гонки пищи. Если пища передается на анализную тарелку, это помешает точному сбору данных.
   6. После окончательной стирки, аспирировать супернатант до 100 йл M9 и червь гранулы остается.
      Внимание: Голод связанных поведения становятся очевидными после 30 минут. Следовательно, черви должны быть немедленно переведены из раствора, как только мыть шаги были завершены.
2. Подготовка анализных плит
   1. Подготовье стандартных агарных пластин NGM за два дня до анализа.
      1. Если пластины хранятся во влажной среде, сделать агар пластин 3 дней до анализа. Кроме того, снимите крышку пластины на 3 - 6 ч, чтобы обеспечить надлежащую сухость (если в стерильной среде).
   2. С толстым постоянным маркером, сделать линию на нижней части пластины вдоль внешнего края, а другой сформировать барьер средней линии (Рисунок 1). Барьер средней линии должен быть равносторонним с каждого края пластины. Используйте линейку для обеспечения точных измерений. Эти линии будут служить в качестве руководства при передаче бактерий и медного раствора. При условии, что кишечная палочка передается перед медным раствором, эти линии будут служить индикаторами.
   3. Семенная пластина с 50 йл ОП50 кишечной палочки только на одной стороне медного барьера для создания равномерного газона (рисунок 2). Бактериальная концентрация должна оставаться последовательной в разных анализах; однако в ответ на умеренные различия в концентрации наблюдалась небольшая изменчивость.
      1. Используйте отмеченные линии на нижней стороне пластины, чтобы убедиться, что бактерии не вступают в контакт с медным раствором. При условии, что медный раствор линии края пластины и образует барьер средней линии, передачи бактерий, так что медный раствор не вступают в контакт с источником пищи.
   4. Отметь второй набор пластин и не перенесите им ОП50 кишечной палочки(рисунок 2). Эти пластины послужат для оценки отрицательного контроля. Эти пластины также должны иметь маркировку на одной половине пластины для обозначения первоначального происхождения передачи.
   5. Разрешить бактериям высохнуть, то инкубировать пластины при 37 градусов по Цельсию на ночь. Убедитесь, что бактериальные пластыри не нарушаются при переводе в инкубатор или комнату с температурой 37 градусов по Цельсию. Чрезмерное нарушение может изменить расположение или форму пищевой патч.
3. Химиотаксис Анализ
   1. Свежеприготовляемый сульфатный раствор на 0,5 М меди (II) до начала анализа. При условии, что на тарелку используется 125 МКЛ раствора, масштабировать этот объем зависит от количества используемых анализных пластин (например, 5 анализных пластин, 625 МКЛ).
   2. Пипетт 100 л сульфатного раствора меди (II) на краю агара для создания внешнего медного барьера. Отмеченная нижняя сторона пластины должна служить в качестве направляющий выступ.
   3. Pipette 25 Л сульфатного раствора меди (II) для создания барьера средней линии.
      1. Убедитесь, что раствор сульфата меди (II) не со контактируют с бактериальным пластырем. Используйте пятнистую технику, как полосы могут повлиять на передвижение из-за отступов / царапин на агаре.
   4. Дайте медному раствору высохнуть на тарелке. Период времени может варьироваться в зависимости от пластины и лабораторных условий. Визуально проверяйте сухость каждые 5 минут после передачи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Медный раствор имеет голубоватый оттенок и легко идентифицируется. Используйте лабораторную ткань, чтобы слегка мазок раствор вблизи края пластины, чтобы различить сухость.
   5. Pipette 20 йл червя гранулы из нижней части трубки на бактерии свободной половине анализа пластины.
      1. Убедитесь, что 10 червей передаются на анализ пластины. Если дополнительные черви были случайно включены, удалите их, собирая с галоуглеродным маслом, чтобы убедиться, что бактерии не добавляются в пластину. Каждый анализ должен иметь последовательное количество нематод во время анализа.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Если во время анализов переносится слишком мало червей, увеличение первоначального размера выборки позволит уменьшить потенциальные потери во время мойки и переносов.
   6. Удалить избыток M9 из пластины с лабораторной ткани. M9 не должен соего контакта с раствором сульфата меди (II).
      Внимание: Убедитесь, что черви и поверхность агара остаются нетронутыми при выполнении этого шага. При слишком жестком использовании, лабораторные ткани могут создавать отступы к поверхности агара пластины и может удалить червей. Черви, случайно удаленные через KimWipe, должны быть удалены.
   7. После того, как решение M9 было удалено и все черви начали нежидкие локомоторные узоры, запустите секундомер анализа.
      1. Оптимально удалите решение M9 в течение минуты. Существенным параметром является выявление синусоидальных локомотивов. Черви локомот по-разному, например, обмолота, а не синуоидной, когда в жидкости. Запустите часы-остановки анализа, как только каждый из экспериментальных организмов перестанет обмолота.
   8. Проверяйте анализные пластины каждые 30 минут.
      1. Для анализа пластин с бактериальными пятнами, положительно оценка организмов, если они достигают пищевой патч в течение 4 часов периода. Для отрицательных контрольных пластин положительно оценка организмов, если они пересекли барьер.

Representative Results

Рисунок 1: Визуальное представление маркировки для обозначения размещения медного раствора на нижней стороне 5-сантиметровой чашки Петри. Эти показания используются для обеспечения того, чтобы разделы пластины были надлежащим образом измерены и служить в качестве ориентира при передаче бактериального патча, а затем медного раствора на поверхность агара.

Рисунок 2: 5 см Петри Блюдо делится на две секции для и вне продовольственной анализ пластин и бактериальной лужайке формируется в центре одного из этих разделов для на-пищевой плиты. Пищевой патч не должен соеговорить с тестовым соединением, которое выровномочено по краям пластины и образует барьер средней линии.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.]			Produced in lab
Cupric Sulfate	Sigma	C-1297	Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M