C. elegans Kemotaxisanalys: En metod för att testa chemosensation i maskar

Overview

Denna video introducerar chemotaxis i nematoden C. elegans och visar ett provprotokoll som testar kemotactic aversion mot kopparsulfat.

Protocol

Följande protokoll är ett utdrag från Campbell et al, A Caenorhabditis elegans Nutritional-Status Based Copper Aversion Assay, J. Vis. Exp. (2017).

1. Beredning av experimentella organismer
   1. Välj 10 L4 stegade nematoder per stam 24 timmar innan analysen påbörjas för att säkerställa att organismer är unga vuxna när de testas. För varje mutant eller kontrollnematod som testas, välj 10 L4s (10 för kontrollen och 10 för analysen).
      1. Underhåll L4-organismer med standardmetoder för 24 timmar på standardagarplattor sådda med OP50 Escherichia coli. Om organismer går förlorade under de efterföljande tvättstegen, kompensera genom att öka startprovstorleken (dvs. plocka 20 maskar snarare än 10).
         OBS: Beteende är en medfödd variabel fenotyp. Utför metoden i tre exemplar för varje stam på tre separata dagar. Inkludera ytterligare kontrollstammar och villkor för nya stammar, som markeras i diskussionsavsnittet.
   2. Omedelbart före analys, överför experimentella organismer till en agarplatta utan bakterier och låt nematoder röra sig fritt i 1 min för att avlägsna överflödiga bakterier.
      1. Om försöksorganismer upplevde kontamineringsförhållanden under 24 timmar före analysen, kassera dem.
   3. Pipett 1 ml M9 på den bakteriefria plattan för att tvätta maskar i ett mikrocentrifugrör.
   4. Centrifugera vid 3 000 x g i 1 minut. Maskar bör bilda en pellet längst ner på röret. Aspirera M9-lösningen utan att störa maskpelleten. Tillsätt 1 ml M9 till maskpelleten, invertera röret för att blanda maskar med lösningen.
   5. Upprepa steg 1.4 tre gånger till.
      1. Om överskott av bakterier ursprungligen överfördes med maskarna, upprepa för totalt 5 gånger. Inga bakterier ska överföras till kopparmatskapplöpningsplattorna. Om mat överförs till analysplattan kommer det att störa korrekt datainsamling.
   6. Efter den slutliga tvätten, aspirera supernatant tills 100 μL M9 och maskpelleten kvarstår.
      Varning: Svältrelaterade beteenden blir uppenbara efter 30 min. Följaktligen bör maskar omedelbart överföras från lösningen när tvättstegen har slutförts.
2. Beredning av analysplattor
   1. Förbered vanliga NGM-agarplattor två dagar före analysen.
      1. Om plattorna förvaras i fuktig miljö, gör agarplattor 3 dagar före analys. Alternativt kan du ta bort locket på plattan i 3 - 6 timmar för att säkerställa korrekt torrhet (om det är i en steril miljö).
   2. Med en tjock permanent markör, gör en linje på undersidan av plattan längs ytterkanten och en annan för att bilda en mittlinjebarriär (Figur 1). Mittlinjens barriär ska vara lika hög från varje kant på plattan. Använd en linjal för att säkerställa exakta mätningar. Dessa linjer kommer att fungera som en guide vid överföring av bakterier och kopparlösningen. Förutsatt att E. coli överförs före kopparlösningen kommer dessa linjer att fungera som indikatorer.
   3. Fröplatta med 50 μL OP50 E. coli på endast ena sidan av kopparbarriären för att skapa en enhetlig gräsmatta (figur 2). Bakteriekoncentrationen bör förbli konsekvent mellan analyserna. Liten variation har dock observerats som svar på milda koncentrationsskillnader.
      1. Använd de markerade linjerna på undersidan av plattan för att säkerställa att bakterierna inte kommer i kontakt med kopparlösningen. Under förutsättning att kopparlösningen fodrar plattans kant och bildar en mittlinjebarriär, överför bakterierna så att kopparlösningen inte kommer i kontakt med livsmedelskällan.
   4. Märk en andra uppsättning tallrikar och överför ingen OP50 E. coli till dem (figur 2). Dessa plattor kommer att tjäna till att utvärdera den negativa kontrollen. Dessa skyltar bör också ha en märkning på ena halvan av plattan för att beteckna det ursprungliga överföringsursprunget.
   5. Låt bakterier torka och inkubera sedan plattor vid 37 °C över natten. Se till att bakteriella fläckar inte störs vid överföring till en inkubator eller rum på 37 °C. Överdriven störning kan ändra platsen eller formen på matplåstret.
3. Kemotaxis analys
   1. Förbered en 0,5 M koppar (II) sulfatlösning före analysens starttid. Förutsatt att 125 μL av lösningen används per platta, skala upp denna volym beroende på antalet analysplattor som används (t.ex. 5 analysplattor, 625 μL).
   2. Pipett 100 μL av koppar (II) sulfatlösningen på kanten av agaren för att skapa en yttre kopparbarriär. Den markerade undersidan av plattan ska fungera som en guide.
   3. Pipett 25 μL av koppar (II) sulfatlösning för att skapa en mittlinjebarriär.
      1. Se till att kopparsulfatlösningen (II) inte kommer i kontakt med bakterieplåstret. Använd en prickig teknik eftersom streckning kan påverka rörelse på grund av indragningar/repor på agar.
   4. Låt kopparlösningen torka på plattan. Tidsperioden kan variera beroende på tallriks- och labbförhållanden. Kontrollera visuellt för torrhet var 5: e minut efter överföringen.
      OBS: Kopparlösningen visar en blåaktig nyans och är lätt att identifiera. Använd en laboratorievävnad för att lätt dab lösningen nära kanten av plattan för att urskilja torrhet.
   5. Pipett 20 μL av maskpelleten från botten av röret till den bakteriefria halvan av analysplattan.
      1. Se till att 10 maskar överförs till analysplattan. Om extra maskar av misstag ingick, ta bort dem genom att plocka med halokarbonolja för att säkerställa att inga bakterier tillsätts på plattan. Varje analys bör ha ett konsekvent antal nematoder under analysen.
         OBS: Om för få maskar överförs under analyser kommer en ökning av den ursprungliga provstorleken att minska potentiella förluster under tvättar och överföringar.
   6. Ta bort överflödig M9 från plattan med en laboratorievävnad. M9 bör inte komma i kontakt med kopparsulfatlösningen (II).
      Varning: Se till att maskar och agarytan förblir opåverkade när du utför detta steg. Om den används för hårt kan laboratorievävnaden skapa indragningar till plattans agaryta och kan ta bort maskar. Maskar som oavsiktligt avlägsnas via KimWipe ska kasseras.
   7. När M9-lösningen har tagits bort och alla maskar har börjat icke-flytande lokomotoriska mönster, starta analysstoppuret.
      1. Optimalt, ta bort M9-lösningen inom en minut. Den väsentliga parametern är identifiering av sinusoidal rörelse. Maskar locomote annorlunda, t.ex. thrashing snarare än sinusoidal, när de är i vätska. Starta analysstoppvakten när var och en av de experimentella organismerna slutar slå.
   8. Kontrollera analysplattorna var 30:e minut.
      1. För analysplattorna med bakteriella fläckar, poängorganismer positivt om de når matplåstret under en 4 timmar lång period. För de negativa kontrollplattorna, poängorganismer positivt om de har korsat barriären.

Representative Results

Bild 1: En visuell representation av markeringar för att indikera kopparlösningsplacering på undersidan av en 5 cm petriskål. Dessa indikationer används för att säkerställa att plattans sektioner har mätts på lämpligt sätt och fungerar som en riktlinje vid överföring av bakterieplåstret och sedan kopparlösning på agarytan.

Bild 2: Den 5 cm petriskålen är uppdelad i två sektioner för på och av matanalysplattor och en bakteriegräsmatta bildas i mitten av ett av dessa sektioner för tallriken på mat. Matplåstret bör inte komma i kontakt med testämnet som linjerar plattans kanter och bildar en mittlinjebarriär.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.]			Produced in lab
Cupric Sulfate	Sigma	C-1297	Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M