C. elegans 化感行为检测实验：一种用于检测线虫化学感应能力的方法

Abstract

来源：Campbell, J. C.，等。一种基于秀丽隐杆线虫营养状态的铜回避检测方法。J. Vis. Exp. (2017)。

本视频介绍了秀丽隐杆线虫（C. elegans）中的趋化性，并展示了一项检测其对硫酸铜趋化回避反应的示例实验方案。

Protocol

以下方案摘自 Campbell 等 A 秀丽隐杆线虫 基于营养状态的铜厌恶检测法 视频实验杂志 (2017).

1. 实验生物材料的制备
   1. 每种品系在开始实验前24小时挑选10只L4期线虫，以确保检测时线虫处于年轻成虫阶段。对每种待测的突变株或对照线虫，分别挑选10只L4期个体（10只用于对照，10只用于实验）。
      1. 使用接种了OP50的标准琼脂平板，按照标准方法培养L4期生物体24小时 大肠杆菌如果在后续洗涤步骤中出现生物体丢失，可通过增加起始样品量来补偿（即 挑选20条而非10条线虫。
         注意： 行为是一种具有内在变异性的表型。每种菌株均需在三个独立的实验日各进行三次重复实验。对于新菌株，应增加对照菌株和实验条件，具体参见讨论部分的说明。
   2. 在检测前立即转移实验用生物体至无细菌的琼脂平板上，让线虫自由移动1分钟，以去除多余的细菌。
      1. 若实验生物在检测前24小时内暴露于污染条件下，则应弃用。
   3. 用移液器将1 mL M9加入无菌平板中，冲洗线虫至微量离心管中。
   4. 在3,000 × g离心1分钟。线虫应在离心管底部形成沉淀。用移液器吸除M9溶液，注意不要扰动线虫沉淀。向线虫沉淀中加入1 mL M9溶液，倒置离心管以混匀线虫与溶液。
   5. 重复步骤 1.4 三次。
      1. 如果最初随线虫转移了过多细菌，需重复操作，共计5次。不得将细菌转移至铜食物竞赛平板。若食物被带入检测平板，将干扰数据的准确采集。
   6. 最后一次洗涤后，吸除上清液，直至剩余约100 µL M9溶液和线虫沉淀。
      注意：饥饿相关行为在30分钟后开始显现。因此，一旦洗涤步骤完成，应立即转移线虫至溶液外。
2. 检测板的制备
   1. 在实验前两天制备标准NGM琼脂平板。
      1. 若平板需保存在潮湿环境中，则应在实验前3天制备琼脂平板。或者，将平板盖打开，在无菌环境中放置3至6小时，以确保充分干燥。
   2. 用粗的永久性记号笔在培养皿底部外缘画一条线，并另画一条线形成中线屏障（图1）。中线屏障应与平板的每一边缘保持等距。使用直尺确保测量精确。这些线条将在转移细菌和铜溶液时起到引导作用。前提是 E. coli 在铜溶液转移之前，这些线条将起到指示作用。
   3. 用50 µL OP50接种种子平板 E. coli 仅在铜屏障的一侧接种，以形成均匀的菌苔（图2）。各次实验中的细菌浓度应保持一致；然而，轻微的浓度差异对实验结果影响较小，变异不明显。
      1. 利用培养皿底部的标记线确保细菌不与铜溶液接触。只要铜溶液沿培养皿边缘分布并形成中线屏障，即可转移细菌，使铜溶液不会接触到食物来源。
   4. 标记第二组平板，并不转移OP50 大肠杆菌 它们（图2）。这些平板将用于评估阴性对照。平板的一侧应做标记，以标明初始转移的来源。
   5. 让细菌干燥，然后将平板在37 °C下培养过夜。转移至37 °C培养箱或室温环境时，确保细菌菌落不受扰动。过度扰动可能改变食物斑块的位置或形态。
3. 趋化性实验
   1. 在开始检测前，新鲜配制 0.5 M 硫酸铜（II）溶液。每块板使用 125 µL 该溶液，根据所用检测板的数量按比例增加溶液体积（例如 5 个检测板，625 µL。
   2. 用移液器将 100 µL 硫酸铜（II）溶液加至琼脂边缘，以形成外部铜屏障。应以平板标记的底面作为加样位置的参考。
   3. 用移液器吸取25 µL硫酸铜（II）溶液，形成中线屏障。
      1. 确保硫酸铜（II）溶液不与细菌菌落接触。采用点接法，避免划线法，因为划线可能在琼脂表面产生凹痕或划痕，从而影响细菌的运动。
   4. 让铜溶液在板上自然干燥。干燥时间可能因板的类型和实验室条件而异。转移后每5分钟目视检查一次干燥情况。
      注意： 铜溶液呈淡蓝色，易于识别。使用实验室纸巾轻轻蘸取培养皿边缘附近的溶液以辨别 干燥性
   5. 用移液器从管底吸取20 µL线虫沉淀，加到检测平板的无菌区域一半。
      1. 确保将10条线虫转移至检测平板。若不慎加入过多线虫，需用碳氢油挑除多余个体，以避免向平板中带入细菌。每次检测所用线虫数量应保持一致。
         注意： 若在检测过程中转移的线虫数量过少，可通过增加初始样品量来减少洗涤和转移过程中的潜在损失。
   6. 用实验室纸巾除去平板上多余的M9。M9不得与硫酸铜溶液接触。
      注意：进行此步骤时，需确保线虫及琼脂表面不受影响。若使用力度过大，实验用纸巾可能在培养皿的琼脂表面留下压痕，并导致线虫被移除。不慎被移除的线虫 通过 KimWipe 应丢弃。
   7. 一旦移除M9溶液且所有线虫开始非液体运动模式，即启动检测计时器。
      1. 理想情况下，应在1分钟内移除M9溶液。关键参数是识别出正弦波状运动。线虫的运动方式各不相同， 例如 在液体中表现为剧烈抖动而非正弦波状运动。当每个实验生物体停止抖动时，立即启动测定计时器。
   8. 每30分钟检查一次检测板。
      1. 对于含有细菌菌斑的检测平板，若生物体在4小时内到达食物菌斑，则记为阳性。对于阴性对照平板，若生物体已越过屏障，则记为阳性。

Results

图1：在5 cm培养皿底部标记铜溶液放置位置的可视化示意图。 这些标记用于确保平板各区域已准确测量，并在将细菌菌块以及铜溶液转移至琼脂表面时提供操作指引。

图2：将5 cm的培养皿分为两个区域，分别用于“有食物”和“无食物”检测平板，并在其...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
M9 溶液 [3 g KH2PO4，6 g Na2HPO4，5 g NaCl，1 ml 1 M MgSO4，加 H2O 至 1 升。使用前高压灭菌]			实验室制备
硫酸铜	Sigma	C-1297	用水适当悬浮至 0.5 M 浓度