ג. אלגנס בדיקת כימוטקסיס: שיטה לבדיקת כימוסנסציה בתולעים

Abstract

מקור: Campbell, J. C., et al. A Caenorhabditis elegans Nutritional-Status Based Copper Aversion. J. Vis. Exp. (2017).

סרטון זה מציג כימוטקסיס בנמטודה C. elegans ומציג פרוטוקול לדוגמה הבודק סלידה כימוטקטית מנחושת גופרתית.

Protocol

הפרוטוקול הבא הוא קטע מתוך Campbell et al, A Caenorhabditis elegans Nutritional-Status Based Copper Aversion Assay, J. Vis. Exp. (2017).

1. הכנת אורגניזמים ניסיוניים
   1. בחר 10 נמטודות מבוימות L4 לכל זן 24 שעות לפני תחילת הבדיקה כדי להבטיח שהאורגניזמים הם בוגרים צעירים בעת הבדיקה. עבור כל מוטציה או נמטודת ביקורת שנבדקה, בחר 10 L4s (10 עבור הבקרה ו -10 עבור הבדיקה).
      1. שמור על אורגניזמים L4 בשיטות סטנדרטיות במשך 24 שעות על לוחות אגר סטנדרטיים שנזרעו עם OP50 Escherichia coli. אם אורגניזמים הולכים לאיבוד במהלך שלבי השטיפה הבאים, לפצות על ידי הגדלת גודל המדגם ההתחלתי (כלומר, לבחור 20 תולעים במקום 10).
         NOTE: התנהגות היא פנוטיפ משתנה מולד. בצעו את השיטה בשלשה לכל זן בשלושה ימים נפרדים. כלול זני בקרה נוספים ותנאים לזנים חדשים, כפי שמודגש בסעיף הדיון.
   2. מיד לפני הבדיקה, העבירו אורגניזמים ניסיוניים לצלחת אגר ללא חיידקים ואפשרו לנמטודות לנוע בחופשיות במשך דקה אחת כדי להסיר חיידקים עודפים.
      1. אם אורגניזמים ניסיוניים חוו תנאי זיהום במהלך 24 השעות שקדמו לבדיקה, השליכו אותם.
   3. פיפטה 1 מ"ל של M9 על הצלחת נטולת החיידקים כדי לשטוף תולעים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה.
   4. צנטריפוגה ב 3,000 x גרם במשך 1 דקה. תולעים צריכות ליצור גלולה בתחתית הצינור. שאפו לתמיסת M9 מבלי להפריע לגלולת התולעת. הוסף 1 מ"ל של M9 לגלולת התולעת, צינור הפוך כדי לערבב תולעים עם הפתרון.
   5. חזור על שלבים 1.4 שלוש פעמים נוספות.
      1. אם עודף חיידקים הועבר בתחילה עם התולעים, לחזור על סך של 5 פעמים. אין להעביר חיידקים לצלחות המירוץ למזון נחושת. אם מזון מועבר לצלחת הבדיקה, זה יפריע לאיסוף נתונים מדויק.
   6. לאחר השטיפה הסופית, שואפים סופרנאטנט עד 100 מיקרוליטר של M9 וגלולת התולעת נשארת.
      אזהרה: התנהגויות הקשורות לרעב מתגלות לאחר 30 דקות. כתוצאה מכך, יש להעביר תולעים באופן מיידי מהתמיסה לאחר השלמת שלבי השטיפה.
2. הכנת צלחות בדיקה
   1. הכינו צלחות אגר NGM סטנדרטיות יומיים לפני הבדיקה.
      1. אם הצלחות נשמרות בסביבה לחה, הכינו צלחות אגר 3 ימים לפני הבדיקה. לחלופין, הסירו את מכסה הצלחת למשך 3-6 שעות כדי להבטיח יובש נאות (אם אתם בסביבה סטרילית).
   2. בעזרת סמן קבוע עבה, צרו קו בחלק התחתון של הלוח לאורך הקצה החיצוני וקו נוסף ליצירת מחסום קו אמצע (איור 1). מחסום קו האמצע צריך להיות במרחק שווה מכל קצה של הצלחת. השתמש בסרגל כדי להבטיח מידות מדויקות. קווים אלה ישמשו כקו מנחה בעת העברת חיידקים ותמיסת נחושת. בתנאי E. coli מועבר לפני פתרון נחושת, קווים אלה ישמשו אינדיקטורים.
   3. צלחת זרעים עם 50 μL של OP50 E. coli רק בצד אחד של מחסום הנחושת ליצירת מדשאה אחידה (איור 2). ריכוז החיידקים צריך להישאר עקבי בכל הבדיקות; עם זאת, נצפתה שונות מועטה בתגובה להבדלים קלים בריכוז.
      1. השתמש בקווים המסומנים בחלק התחתון של הצלחת כדי להבטיח שהחיידקים לא יבואו במגע עם תמיסת הנחושת. בתנאי שתמיסת הנחושת מצפה את קצה הצלחת ויוצרת מחסום קו אמצע, מעבירים את החיידקים כך שתמיסת הנחושת לא תבוא במגע עם מקור המזון.
   4. סמנו קבוצה שנייה של צלחות ולא העבירו אליהן OP50 E. coli (איור 2). לוחות אלה ישמשו להערכת השליטה השלילית. לוחות אלה צריכים גם להיות סימון על מחצית אחת של הצלחת כדי לציין את מקור ההעברה הראשוני.
   5. אפשרו לחיידקים להתייבש ואז דגרו על צלחות בטמפרטורה של 37°C למשך הלילה. יש לוודא כי מדבקות חיידקים אינן מופרעות בעת העברה לאינקובטור או לחדר של 37 מעלות צלזיוס. הפרעה מוגזמת עלולה לשנות את המיקום או הצורה של כתם המזון.
3. בדיקת כימוטקסיס
   1. הכינו תמיסת נחושת סולפט בנפח 0.5 מ' (II) לפני מועד תחילת הבדיקה. בתנאי שנעשה שימוש ב-125 מיקרוליטר של התמיסה לכל צלחת, הגדילו נפח זה בהתאם למספר לוחות הבדיקה שבהם נעשה שימוש (למשל 5 לוחות בדיקה, 625 מיקרוליטר).
   2. פיפטה 100 μL של תמיסת נחושת (II) סולפט על קצה האגר ליצירת מחסום נחושת חיצוני. החלק התחתון המסומן של הצלחת צריך לשמש כמדריך.
   3. פיפטה 25 μL של תמיסת נחושת (II) סולפט ליצירת מחסום קו אמצע.
      1. ודא שתמיסת הנחושת (II) סולפט אינה באה במגע עם המדבקה החיידקית. השתמש בטכניקה מנומרת מכיוון שפסים עלולים להשפיע על התנועה עקב כניסות / שריטות על האגר.
   4. הניחו לתמיסת הנחושת להתייבש על הצלחת. פרק הזמן יכול להשתנות בהתאם לתנאי הצלחת והמעבדה. יש לבדוק ויזואלית אם יש יובש כל 5 דקות לאחר ההעברה.
      NOTE: תמיסת הנחושת מציגה גוון כחלחל וניתן לזיהוי בקלות. השתמש ברקמת מעבדה כדי לטפוח קלות את התמיסה ליד קצה הצלחת כדי להבחין ביובש.
   5. פיפטה 20 μL של גלולת התולעת מתחתית הצינור אל החצי נטול החיידקים של צלחת הבדיקה.
      1. ודא כי 10 תולעים מועברות לצלחת הבדיקה. אם תולעים נוספות נכללו בטעות, הסירו אותן על ידי קטיף עם שמן הלוקרבון כדי להבטיח שלא יתווספו חיידקים לצלחת. לכל בדיקה צריך להיות מספר עקבי של נמטודות במהלך הבדיקה.
         NOTE: אם מעט מדי תולעים מועברות במהלך הבדיקה, הגדלת גודל המדגם הראשוני תפחית הפסדים פוטנציאליים במהלך שטיפות והעברות.
   6. הסר עודף M9 מהצלחת עם רקמת מעבדה. M9 לא אמור לבוא במגע עם תמיסת נחושת (II) סולפט.
      אזהרה: ודא שהתולעים ומשטח האגר לא יושפעו בעת ביצוע שלב זה. אם משתמשים בה בצורה חריפה מדי, רקמת המעבדה יכולה ליצור שקעים במשטח האגר של הצלחת ויכולה להסיר תולעים. תולעים שהוסרו בטעות באמצעות KimWipe יש להשליך.
   7. לאחר שתמיסת M9 הוסרה וכל התולעים החלו בדפוסי תנועה לא נוזליים, הפעל את שעון העצר של הבדיקה.
      1. באופן אופטימלי, הסר את פתרון M9 תוך דקה. הפרמטר המהותי הוא זיהוי התנועה הסינוסואידית. תולעים לוקומוטה באופן שונה, למשל חבטות ולא סינוסואידליות, כאשר הן בנוזל. התחל את שעון העצירה של הבדיקה ברגע שכל אחד מהאורגניזמים הניסיוניים מפסיק לפעום.
   8. בדוק את צלחות הבדיקה כל 30 דקות.
      1. עבור צלחות הבדיקה עם מדבקות חיידקים, ציון חיובי אורגניזמים אם הם מגיעים למדבקה מזון על פני תקופה של 4 שעות. עבור לוחות הבקרה השליליים, ציון חיובי אורגניזמים אם הם חצו את המחסום.

Results

איור 1: ייצוג חזותי של סימונים המעידים על מיקום תמיסת נחושת בצדה התחתון של צלחת פטרי בקוטר 5 ס"מ. אינדיקציות אלה משמשות כדי להבטיח שחלקי הצלחת נמדדו כראוי ומשמשות כקו מנחה בעת העברת המדבקה החיידקית ולאחר מכן תמיסת הנחושת על משטח האגר.

איור 2: צלחת פטרי בקוטר 5 ס"מ מחול...

Materials

<גבול טבלה="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:929px;" width="929"> List of materials used in this article Name Company Catalog Number Comments M9 פתרון [3 גרם KH2PO4, 6 גרם Na2HPO4, 5 גרם NaCl, 1 מ"ל 1 M MgSO4, H2O עד 1 ליטר. אוטוקלאבה לעיקור לפני השימוש.] מיוצר במעבדה Cupric Sulfate סיגמא C-1297 יש להשתמש במים כדי להשהות כראוי לריכוז של 0.5M