C. elegans Muscle Area Measurements: een gestandaardiseerde methode om gerigeerde spiermorfologie te kwantificeren

Overview

C. elegans hebben twee soorten spieren, enkele sarcomere en meerdere sarcomere, of geriste spieren.  Deze video beschrijft de opstelling van de geriste lichaamswandspieren, die verantwoordelijk zijn voor de voortbewegingvaneen worm en bevat een monsterprotocol om spiermorfologie te meten met behulp van beeldanalysesoftware.

Protocol

Dit protocol is ontleend aan Teoh et al, Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).

1. Kwantificeren van lichaamswand spierstructuur

1. Fluorescentie beeldvorming van lichaamswand spierstructuur
   1. Verkrijg een stam (bijvoorbeeld RW1596) die de transgene stEx30 (Pmyo-3::gfp::myo-3 + rol-6(su1006))draagt, die myosinevezels labelt met GFP.
      OPMERKING: Introductie van het transgene in dieren kan worden bereikt door ofwel een soort van interesse te kruisen met dieren die het transgene al uitdrukken, ofwel DNA in de distale arm van de geslachtsklier te micro-inbrengen. Het 'rollende' fenotype geïnduceerd door rol-6 mutatie in dit transgene vergemakkelijkt de visualisatie van de spieren. De lichaamswandspieren lopen langs de dorsale en ventrale zijden die normaal gesproken niet zichtbaar zijn bij wilde dieren omdat ze meestal aan een van hun laterale zijden liggen. Het rol-6(su1006) allel induceert het draaien van de dieren, waardoor sommige spiercellen worden blootgesteld voor beeldvorming.
   2. Beeld de dieren met behulp van een fluorescentiemicroscoop in combinatie met een hoge resolutie opgeladen gekoppelde apparaatcamera (CCD), 40X objectief of hoger, GFP-filter en acquisitiesoftware.
   3. Pas de belichtingstijd en verlichtingsintensiteit aan om oververzadigde beelden te voorkomen.
   4. Leg beelden van spieren (400X vergroting) vast en bewaar deze op een deel van het dier dat ten minste één volledig zichtbare schuine spiercel bevat. Vermijd regio's met een enkele spiercel die onvolledig is of secties die niet scherp zijn. Sluit ook afbeeldingen uit van extreme voorste en achterste regio's en regio's die grenzen aan de vulva.
      OPMERKING: Als het dier geen enkele zichtbare volledige spiercel heeft, schuift u voorzichtig de afdeklip om het dier te draaien om een volledige cel bloot te leggen.
2. Meting van het spiercelgebied
   1. Open de afbeelding in Fiji-software (versie 2.0.0 werd gebruikt in deze studie).
   2. Gebruik de polygoonselectie om voorzichtig rond een enkele schuine spiercel te sporen. Pas de lijn van de polygoon aan het einde aan door de ankerpunt te slepen om de tracering te verbeteren.
   3. Ga naar het tabblad Analyseren boven aan de software en klik op Meten om het gebied van de selectie te berekenen. Er wordt een aparte resultatentabel met het gebied en andere metingen weergegeven. Als de gebiedsmeting ontbreekt in de resultatentabel, gaat u naar Metingen instellenonder het tabblad Analyseren en controleert u of hetgebiedsvak is aangevinkt. Evenzo, untick andere metingen die niet nodig zijn. 
   4. Voor spiercellen met een ontaard/ontbrekend gebied traceert u het ontbrekende gebied met het gereedschap Polygoonselectie en klikt u nogmaals op Meten. Als er meerdere openingen in de cel zijn, traceert u elke opening afzonderlijk.
   5. Bereken de verhouding tussen het spleetgebied en de gehele enkele spiercel. Een hoge verhouding duidt op een hogere mate van spierdegeneratie als gevolg van grote openingen in de cel. Als er geen gebieden ontbreken, zoals vaak wordt gezien bij wilde dieren, wordt de verhouding berekend als nul.
      OPMERKING: Als controle, score ook voor spierstructuur defecten visueel en vergelijk de resultaten met de kwantitatieve meting. Dit is vooral handig als de stam voor het eerst in het lab wordt bestudeerd. Voor fenotypische scoring, beoordeel de dieren als defect of niet-defect op basis van de integriteit van de filamenten. Dieren met verlies van verschillende filamenttriaties, GFP-klonteren of gaten in spiercellen als gevolg van structurele afbraak, zouden bijvoorbeeld als defect worden beoordeeld.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Confocal microscope	Leica	TCS SP8	Inverted platform
Fluorescence microscope	Carl Zeiss AG	Zeiss Axio Imager M2
Glass coverslips #1	Thermo scientifique	MENCS22221GP
Glass coverslips #1.5	Zeiss	474030-9000-000	Made by SCHOTT
Glass slides	Thermo scientifique	MENS41104A/40