Epidermale laserwonden: gelokaliseerde schade veroorzaken om reparatieprocessen in C. elegans te onderzoeken

Overview

Deze video introduceert een methode van laserwonden, die wordt gebruikt om zeer nauwkeurige verwondingen in de wormepidermis te veroorzaken.  Het monsterprotocol is afkomstig van een onderzoek naar wondrespons en herstel.

Protocol

Dit protocol is een uittreksel uit Xu en Chisholm, Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans, J. Vis. Exp. (2014).

1. Laser verwonden

OPMERKING: Gebruik femtoseconde laserbestraling (800 nm) om nauwkeuriger te verwonden.

1. Bereid agar pads op een glazen glijbaan met gesmolten 2% agar. Zorg ervoor dat de pads vergelijkbaar zijn met de agar pads die worden gebruikt voor live beeldvorming van C. elegans.
2. Breng 10 jongvolwassen wormen over op het agarosepad met wormpluk en voeg een druppel van 2 μl levamisole-oplossing van 12 mM toe. Bedek de dieren en de vloeistof met een afdeklip. Wacht 1-2 minuten tot de wormen verlammen.
3. Plaats de glazen schuif op een confocale microscoop van de draaiende schijf. Verplaats het stadium om de wormen te vinden en concentreer je op de laterale voorste of achterste syncytiële epidermis met een 100X-doelstelling (NA 1.4-1.46).
4. Stel het vermogen van de femtoseconde laser in op 140 mW (gemeten voor het objectief). Gebruik de femtoseconde laser bij een herhalingssnelheid van 80 MHz.
   OPMERKING: Twee pulsen van elk 200 msec (gescheiden door 20 msec) zijn voldoende om in onze handen te verwonden.
5. Focus op het apicale oppervlak van de epidermale cel en wond de epidermis. Let op lokale verstoring van het cytoplasma (borrelen) of lokaal bleken van een gebruikte fluorescerende marker.
   OPMERKING: Volg de juiste laserveiligheidsprocedures bij het gebruik van de femtoseconde laser. Lijn- of puntscans met femtosecondelasers zoals die in twee fotonmicroscopen moeten voldoende vermogen bieden voor laserwonden.
   OPMERKING: Hoewel we geen directe ervaring hebben met het gebruik van andere lasers, moet verwonden in principe mogelijk zijn met conventionele UV-lasers (zoals gebruikt bij C. elegans cel ablaties). Gebruik eventueel een Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) module op draaiende schijf confocale om de epidermis te verwonden (N. Pujol, persoonlijke communicatie).