Blessure épidermique au laser : induire des dommages localisés pour examiner les processus de réparation dans C. elegans

Overview

Cette vidéo introduit une méthode de blessure au laser, qui est utilisé pour causer des blessures très précises dans l’épiderme ver.  Le protocole de l’échantillon est iso loin d’une étude sur la réponse et la réparation des plaies.

Protocol

Ce protocole est un extrait de Xu et Chisholm, Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans, J. Vis. Exp. (2014).

1. Blessure au laser

REMARQUE: Utilisez l’irradiation au laser femtoseconde (800 nm) pour effectuer des blessures plus précises.

1. Préparer les coussinets d’agar sur une glissade en verre avec une agar fondue de 2 %. Assurez-vous que les coussinets sont semblables aux coussinets d’agar utilisés pour l’imagerie en direct de C. elegans.
2. Transférer 10 jeunes vers adultes sur la garniture d’agarose avec le pic de ver, et ajouter une goutte de 2 μl de solution levamisole de 12 mM. Couvrir les animaux et le liquide d’un bordereau de couverture. Attendez 1-2 min pour que les vers paralysent.
3. Placez la glissière en verre sur un microscope confocal à disque filature. Déplacez la scène pour trouver les vers et concentrez-vous sur l’épiderme syncytial antérieur ou postérieur latéral avec un objectif de 100X (NA 1.4-1.46).
4. Réglez la puissance du laser femtoseconde à 140 mW (mesurée avant l’objectif). Utilisez le laser femtoseconde à un taux de répétition de 80 MHz.
   REMARQUE: Deux impulsions de 200 msec chacune (séparées par 20 msec) sont suffisantes pour nous blesser dans les mains.
5. Concentrez-vous sur la surface apique de la cellule épidermique et blesse l’épiderme. Observez la perturbation locale du cytoplasme (bouillonnement) ou le blanchiment local de tout marqueur fluorescent utilisé.
   REMARQUE: Suivez les procédures de sécurité laser appropriées lors de l’utilisation du laser femtoseconde. Les balayages de ligne ou de point utilisant des lasers femtoseconde tels que ceux dans deux microscopes de photons devraient fournir la puissance suffisante pour blesser au laser.
   REMARQUE: Bien que nous n’avons pas d’expérience directe de l’utilisation d’autres lasers, en principe la blessure devrait être possible en utilisant des lasers UV conventionnels (comme utilisé dans les ablations cellulaires C. elegans). En option, utilisez un module de récupération de fluorescence après photobleaching (FRAP) sur le disque de filature confocal pour blesser l’épiderme (N. Pujol, communication personnelle).