Overview
וידאו זה מציג שיטה של פצע לייזר, אשר משמש כדי לגרום לפציעות מדויקות מאוד באפידרמיס התולעת. פרוטוקול הדגימה הוא ממחקר של תגובת פצע ותיקון.
Protocol
פרוטוקול זה הוא קטע מתוך שו וצ'יזהולם, שיטות לפצע בעור ו Assays עבור תגובות פצע C. elegans, J. Vis. Exp. (2014).
1. פציעת לייזר
שים לב: השתמש הקרנת לייזר femtosecond (800 ננומטר) כדי לבצע פצע מדויק יותר.
- מכינים רפידות אגר על מגלשת זכוכית עם אגר מומס 2%. ודאו שהרידות דומות לרפידות האגאר המשמשות להדמיה חיה של C. elegans.
- להעביר 10 תולעים מבוגרים צעירים על כרית agarose עם לבחור תולעת, ולהוסיף טיפה 2 μl של 12 mM Levamisole פתרון. מכסים את החיות ואת הנוזל עם תלוש כיסוי. חכה 1-2 דקות לתולעים לשתק.
- הנח את שקופית הזכוכית על מיקרוסקופ קונפוקאלי של דיסק מסתובב. הזז את הבמה כדי למצוא את התולעים ולהתמקד באפידרמיס האחורי או האחורי עם מטרה 100X (NA 1.4-1.46).
- הגדר את העוצמה של לייזר femtosecond ל 140 mW (נמדד לפני המטרה). השתמש בלייזר femtosecond בקצב חזרה של 80 מגה-הרץ.
שים לב: שני פולסים של 200 msec כל אחד (מופרדים על ידי 20 msec) מספיקים לפציעה בידיים שלנו. - התמקדו במשטח האפידרמיס ופצעו את האפידרמיס. שימו לב לשיבושים מקומיים של הציטופלסמה (מבעבעת), או הלבנה מקומית של כל סמן פלואורסצנטי המשמש.
שים לב: בצע את נהלי בטיחות הלייזר המתאימים בעת שימוש בלייזר femtosecond. סריקות קו או נקודה באמצעות לייזרים femtosecond כגון אלה בשני מיקרוסקופים פוטון צריך לספק מספיק כוח עבור פצעי לייזר.
שים לב: אמנם אין לנו ניסיון ישיר של שימוש לייזרים אחרים, באופן עקרוני פצע צריך להיות אפשרי באמצעות לייזרים UV קונבנציונאלי (כפי שנעשה שימוש C. elegans אבלציות תא). באופן אופציונלי, השתמש במודול שחזור פלואורסצנטי לאחר פוטובלצ'ינג (FRAP) בדיסק מסתובב קונפוקל כדי לפצוע את האפידרמיס (N. Pujol, תקשורת אישית).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
