Herida láser epidérmica: Inducción de daños localizados para examinar los procesos de reparación en C. elegans

Overview

Este video introduce un método de herida láser, que se utiliza para causar lesiones muy precisas en la epidermis del gusano.  El protocolo de muestra es de un estudio de la respuesta y reparación de heridas.

Protocol

Este protocolo es un extracto de Xu y Chisholm, Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans, J. Vis. (2014).

1. Heridas láser

NOTA: Utilice la irradiación láser de femtosegundo (800 nm) para realizar heridas más precisas.

1. Prepare almohadillas de agar en un tobogán de vidrio con agar derretido del 2%. Asegúrese de que las almohadillas sean similares a las almohadillas de agar utilizadas para la toma de imágenes en vivo de C. elegans.
2. Transfiera 10 gusanos adultos jóvenes a la almohadilla de agarose con selección de gusanos y agregue una gota de 2 μl de solución de Levamisole de 12 mM. Cubra los animales y el líquido con un resbalón de cubierta. Espere 1-2 minutos para que los gusanos se paralicen.
3. Coloque la diapositiva de vidrio en un microscopio confocal de disco giratorio. Mueva el escenario para encontrar los gusanos y concéntrese en la epidermis sincitita anterior o posterior lateral con un objetivo de 100X (NA 1.4-1.46).
4. Ajuste la potencia del láser femtosecond a 140 mW (medido antes del objetivo). Utilice el láser femtosegundo a una velocidad de repetición de 80 MHz.
   NOTA: Dos pulsos de 200 msec cada uno (separados por 20 msec) son suficientes para herirnos en las manos.
5. Concéntrate en la superficie apical de la célula epidérmica e hiere la epidermis. Observe la interrupción local del citoplasma (burbujeo) o el blanqueamiento local de cualquier marcador fluorescente utilizado.
   NOTA: Siga los procedimientos de seguridad láser adecuados cuando utilice el láser femtosecond. Las exploraciones de línea o puntos utilizando láseres de femtosegundo, como los de dos microscopios fotónico, deben proporcionar suficiente potencia para las heridas láser.
   NOTA: Si bien no tenemos experiencia directa en el uso de otros láseres, en principio la herida debe ser posible utilizando láseres UV convencionales (como se utiliza en las ablaciones celulares C. elegans). Opcionalmente, utilice un módulo de recuperación de fluorescencia después de fotobleaching (FRAP) en el disco giratorio confocal para herir la epidermis (N. Pujol, comunicación personal).