Microinyección de Gonad: Un método de entrega compuesta directamente en la línea germinosa de C. elegans

Abstract

Fuente: Farboud, B. et al, Edición mejorada del genoma con Cas9 Ribonucleoprotein en diversas células y organismos. J. Vis. (2018). 

Este video describe la microinjección, un método común de creación de cepas transgénicas de C. elegans.   En el ejemplo, veremos microinyección utilizada para introducir un complejo de ribonucleoproteína (RNP) para la edición de genes de bases CRISPR.

Protocol

El siguiente protocolo es un extracto de Farboud et al, Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms, J. Vis. Exp. (2018). 1. Asamblea RNP Diseñe el experimento con mucha antelación, adquiriendo todos los componentes de ARN, ADN y proteínas con anticipación. Como primer paso, pruebe uno d…

Representative Results

Tabla 1: Controles positivos para experimentos preliminares de edición del genoma. Esta tabla muestra la información clave necesaria para realizar un experimento de edición del genoma por primera vez en cada una de las células y organismos descritos en este protocolo. Seguir estos parámetros es probable que produzca un resultado exitoso que se pueda utilizar para probar el protocolo o como línea base…

Materials

Reagents/Materials
DNA oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	–	IDT will provide custom DNA sequences, including those in Table 1
Guide RNAs	Synthego	–	Synthego will provide high-quality sgRNAs for S. pyogenes Cas9, including custom sgRNAs containing the targeting sequences included in Table 1
Purified Cas9 protein (EnGen Cas9 NLS, S. pyogenes)	New England Biosciences	M0646T	If possible, purifying Cas9 in-house or purchasing from local core facilities is a less expensive option
OP50 Escherichia coli	Caenorhabditis Genetics Center	OP-50	https://cgc.umn.edu/
Nematode Growth Media agar in petri dishes	–	–	See Stiernagle, T (ref. 59)
Standard borosilicate glass capillaries with filament:  4 in (100 mm), 1/0.58 OD/ID	World Precision Instruments	1B100F-4
Single-barrel standard borosilicate glass capillaries: 6 in (152 mm), 2/1.12 OD/ID	World Precision Instruments	1B200-6
Cover glass; 24 × 50 mm	Thermo Fisher Scientific	12-544E
Cover glass; 22 × 22 mm	Thermo Fisher Scientific	12-518-105K
Apex LE agarose	Genesee Scientific	20-102
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-100ML
pCFJ90 plasmid	Addgene	19327
Capillary tubes with filament: 4 in (1.0 mm)	World Precision Instruments	T2100F-4
Petri dishes (100 × 15 mm)	–
9" pasteur pipettes	–
Nuclease-free water	–
Equipment
MZ75 Stereomicroscope	Leica	Out-of-production. Current model is the M80 Stereomicroscope
Axio Vert35 inverted phase contrast fluorescent microscope	Zeiss	Out-of-production. Current model is the Axio VertA.1
Laser-based micropipette puller (for C. elegans protocol)	Sutter Instrument	FG-P2000
Picoliter Microinjector (for C. elegans protocol)	Warner Instruments	PLI-100A
Three-axis Joystick oil hydraulic micromanipulator	Narishige International	MO-202U
Coarse manipulator	Narishige International	MMN-1
Microloader pipette tips	Eppendorf	5242956003
NG-agar