Irradiation UV : une méthode pour intégrer les tableaux extrachromosomiques

Overview

La microinjection des transgènes entraîne habituellement des souches de C. elegans avec de grands tableaux extrachromosomiques, ce qui entraîne une expression et une transmission variables du transgène.  L’irradiation UV peut induire une intégration chromosomique du réseau et une transmission transgénique plus stable.

Protocol

Ce protocole est un extrait de Mariol et coll., A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome, J. Vis. Exp. (2013).

1. Irradiation UV et rétablissement des vers transgéniques

1. Irradiation du ver :
   1. Choisissez 30 à 100 animaux transgéniques fluorescents L4 sur des plaques de culture séparées (15-20 animaux par plaque).
   2. Placer les plaques, avec les couvercles enlevés, dans un lien croisé UV. Irradier les vers à 0,012 J/cm². Notez que les souches sont plus ou moins sensibles aux UV et que les résultats peuvent être variables selon l’irradiateur UV utilisé. Une dose comprise entre 0,010 et 0,015 J/cm² peut être testée.
2. Rétablissement du ver après irradiation :
   1. Placer les assiettes avec des vers irradiés toute la nuit à 15 °C pour la récupération.
   2. Vérifiez le nombre d’animaux vivants. Entre nos mains, un taux de survie d’environ 80-90% est adapté pour une irradiation efficace.
   3. Faire pousser les animaux irradiés à 15-25 °C jusqu’à ce que la descendance ait atteint le stade de développement permettant l’observation de l’expression du marqueur de coinjection.

2. Isolement des lignes transgéniques intégrées

1. Sélection d’animaux F1:
   1. Single 150-200 animaux fluorescents F1 sur des plaques de culture séparées. Pour les lignes très transmettantes (≥80%), 100 animaux F1 suffisent.
   2. Gardez ces plaques F1 à 15-25 °C jusqu’à ce que la descendance atteigne un stade approprié pour l’observation des animaux F2 fluorescents.
   3. Jetez toutes les plaques F1 présentant soit i) aucune descendance, ce qui indique que l’animal F1 était stérile ou mort, ou ii) pas ou seulement peu d’animaux fluorescents F2, ce qui indique que l’animal F1 n’a pas transmis le transgène au rythme prévu. Cette étape est rapide et représente un réel avantage par rapport au protocole standard qui nécessite une estimation du pourcentage de vers F2 fluorescents afin de sélectionner les plaques F1 présentant une descendance fluorescente de ≥75 % (tableau 1).
2. Sélection d’animaux F2:
   1. Seulement quatre animaux transgéniques fluorescents F2 de chaque plaque F1 sélectionnée. Lors de l’utilisation de transgènes fluorescents (par exemple mCherry, gfp, ou dsRed), choisissez des vers F2 avec un niveau élevé de fluorescence car cela pourrait indiquer que ces animaux sont homozygotes pour le tableau intégré. Notez que lors de la cueillette des animaux F2, il est essentiel de ne pas transporter d’œufs ou de larves, afin d’éviter les faux négatifs à l’étape suivante.
   2. Cultivez des animaux F2 à 15-25 °C.
3. Isolement et validation des souches transgéniques intégrées :
   1. Filtrez les plaques F2 pour les vers F3 transgéniques 100% fluorescents. L’écran est assez rapide car la présence d’un seul ver non fluorescent indique que la plaque doit être jetée. Un homozygous d’animal F2 pour le transgène intégré donnera la descendance fluorescente 100% homozygote.
   2. Huit animaux F3 fluorescents à partir de plaques sélectionnées pour confirmer l’héritage 100% du transgène. En théorie, la cueillette d’un animal suffit à cette étape. Cependant, la cueillette de huit animaux fluorescents F3 peut être nécessaire pour éviter de sélectionner des animaux stériles ou malsains que l’irradiation peut induire au hasard des mutations qui affectent les gènes importants pour la physiologie des vers.
   3. Si possible, conserver plusieurs souches transgéniques intégrées indépendantes, c’est-à-dire des souches récupérées chez différents animaux F1.

Representative Results

Tableau 1. Comparaison des protocoles standard et amélioré pour l’intégration des tableaux extrachromosomiques dans legénome de C. elegans. Deux transgènes non intégrés transmettant à peu près à la même fréquence ont été intégrés en utilisant la norme ou le protocole amélioré. La principale différence réside dans le fait que dans le protocole standard un écran de la descendance sur toutes les plaques F1 est effectué pour estimer le pourcentage de vers transgéniques F2, qui devrait être ≥ 75%. Cette étape prend beaucoup de temps, surtout si le taux initial de transmission est proche de 75%. Dans le protocole amélioré, il suffit de singler quatre vers F2 de chaque plaque F1 transportant des animaux transgéniques F2 et de dépister 100% des vers transgéniques dans la descendance (F3), qui peuvent être effectués rapidement. Le protocole standard est adapté.  

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
U.V. cross-linker	Fischer Scientific		Wavelength 254 nm
Microscope SteREO Discovery V8	Carl Zeiss, Inc.
Petri dishes, 60 mm	CML	BPS55E6
Platinium wire 0.25 mm	Alfa Aesar	6/4/7440	To make a pick for worms