הקרנת UV: שיטה לשילוב מערכים חוץ-כרומוזומליים

Overview

מיקרו-אינג'ים של טרנסגנים גורמים בדרך כלל לזנים C. elegans עם מערכים חוץ-סימטריים גדולים, אשר גורמים לביטוי משתנה והעברת הטרנסג'ין.  הקרנת UV יכולה לגרום לאינטגרציה כרומוזומלית של המערך ולתמסורת טרנסג'ינית יציבה יותר.

Protocol

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Mariol et al, פרוטוקול מהיר לשילוב מערכים אקסטרכרומוזומליים עם קצב שידור גבוה לתוך הגנום C. elegans , J. Vis. Exp. (2013).

1. הקרנת UV והתאוששות של תולעים מהונדסות

1. הקרנת תולעים:
   1. בחרו 30-100 חיות L4 פלואורסצנטיות מהונדסות על צלחות תרבות נפרדות (15-20 בעלי חיים לפי צלחת).
   2. מניחים את הצלחות, עם העפעפיים הוסרו, ב UV cross-linker. הקרנתי את התולעים ב 0.012 J / cm². שים לב כי זנים רגישים פחות או יותר UV וכי התוצאות יכולות להיות משתנות בהתאם קרינה UV בשימוש. ניתן לבדוק טווח מינון בין 0.010-0.015 J/cm^2.
2. התאוששות תולעת לאחר הקרנה:
   1. מניחים צלחות עם תולעים מוקרן לילה ב 15 מעלות צלזיוס להתאוששות.
   2. תבדקו את מספר החיות שחיות. בידינו, שיעור הישרדות של סביב 80-90% מותאם הקרנה יעילה.
   3. לגדל את בעלי החיים מוקרן ב 15-25 מעלות צלזיוס עד הצאצאים הגיע לשלב ההתפתחותי המאפשר תצפית של ביטוי סמן coinjection.

2. בידוד קווים מהונדסים משולבים

1. מבחר בעלי חיים F1:
   1. 150-200 חיות F1 פלואורסצנטיות בודדות על צלחות תרבות נפרדות. עבור קווים משדרים מאוד (≥80%), 100 F1 בעלי חיים מספיקים.
   2. שמור אלה F1 צלחות ב 15-25 מעלות צלזיוס עד הצאצאים מגיע לשלב המתאים לתצפית של בעלי חיים F2 פלואורסצנטי.
   3. השלך את כל צלחות F1 המציגות או i) אין צאצאים, המציין כי החיה F1 היה סטרילי או מת, או ii) לא או רק כמה בעלי חיים F2 פלואורסצנטי, המציין כי החיה F1 לא להעביר את transgene בקצב הצפוי. שלב זה הוא מהיר ומייצג יתרון אמיתי בהשוואה לפרוטוקול הסטנדרטי הדורש הערכה של אחוז תולעי F2 פלואורסצנטיות על מנת לבחור לוחות F1 המציגים ≥75% צאצאי פלורסנט (טבלה 1).
2. מבחר בעלי חיים F2:
   1. ארבע חיות F2 פלואורסצנטיות פלואורסצנטיות מכל צלחת F1 שנבחרה. בעת שימוש בטרנסג'ינים פלואורסצנטיים (לדוגמה mCherry, gfp או dsRed), בחר תולעי F2 עם רמה גבוהה של פלואורסצנטיות מכיוון שהדבר יכול להצביע על כך שבעלי חיים אלה הם הומוזיגיים עבור המערך המשולב. שים לב כי בעת קטיף בעלי חיים F2 זה קריטי לא לשאת יחד ביצים או זחלים, על מנת למנוע שליליות שווא בשלב הבא.
   2. לגדל F2 בעלי חיים ב 15-25 מעלות צלזיוס.
3. בידוד ואימות של זנים מהונדסים משולבים:
   1. לוחות F2 מסך עבור תולעי F3 פלואורסצנטיות פלואורסצנטיות. המסך הוא די מהיר כמו נוכחות של תולעת אחת nonfluorescent מציין כי הצלחת צריכה להיזרק משם. F2 בעלי חיים homozygous עבור transgene משולב ייתן 100% הומוזיגי פלואורסצנטי צאצאים.
   2. שמונה חיות F3 פלואורסצנטיות בודדות מלוחות נבחרים כדי לאשר את הירושה של 100% של הטרנסג'ין. בתיאוריה, לקטוף חיה אחת זה מספיק בשלב הזה. עם זאת, ייתכן שיהיה צורך לקטוף שמונה בעלי חיים פלואורסצנטיים F3 כדי להימנע מבחירת בעלי חיים לא עקרים או לא בריאים, שכן הקרנה יכולה לגרום באופן אקראי למוטציות המשפיעות על גנים החשובים לפיזיולוגיה של התולעת.
   3. אם אפשר לשמור על כמה זנים מהונדסים משולבים עצמאיים, כלומר זנים התאוששו מבעלי חיים F1 שונים.

Representative Results

שולחן 1. השוואה בין הפרוטוקולים הסטנדרטיים והמשופרת לשילוב מערכים חוץ-סימטרייםבגנום C. elegans. שני טרנסג'נים לא משולבים המשדרים בערך באותו תדר שולבו באמצעות התקן או הפרוטוקול המשופר. ההבדל העיקרי טמון בעובדה כי בפרוטוקול הסטנדרטי מסך של הצאצאים על כל לוחות F1 מבוצע כדי להעריך את אחוז תולעי F2 מהונדסות, אשר צריך להיות ≥ 75%. צעד זה אורך זמן רב, במיוחד אם שיעור השידור הראשוני קרוב ל-75%. בפרוטוקול המשופר, מספיק לבודד ארבע תולעי F2 מכל צלחת F1 הנושאת חיות F2 מהונדסות ולסנן עבור 100% מהתולעים הטרנסגניות בצאצאים (F3), אשר ניתן לבצע במהירות. הפרוטוקול הסטנדרטי מותאם.  

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
U.V. cross-linker	Fischer Scientific		Wavelength 254 nm
Microscope SteREO Discovery V8	Carl Zeiss, Inc.
Petri dishes, 60 mm	CML	BPS55E6
Platinium wire 0.25 mm	Alfa Aesar	6/4/7440	To make a pick for worms