Irradiazione UV: Un metodo per integrare array extracromosomiali

Overview

La microiniezione dei transgeni di solito si traduce in ceppi C. elegans con grandi array extracromosomiali, che si traducono in espressione variabile e trasmissione del transgene.  L'irradiazione UV può indurre l'integrazione cromosomica dell'array e una trasmissione transgena più stabile.

Protocol

Questo protocollo è un estratto da Mariol et al,A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate in the C. elegans Genome, J. Vis. Exp. 

1. Irradiazione UV e recupero di vermi transgenici

1. Irradiazione dei vermi:
   1. Scegli 30-100 animali fluorescenti transgenici L4 su piastre di coltura separate (15-20 animali per piatto).
   2. Posizionare le piastre, con i coperchi rimossi, in un cross-linker UV. Irradiare i vermi a 0,012 J/cm². Si noti che i ceppi sono più o meno sensibili ai raggi UV e che i risultati possono essere variabili a seconda dell'irradiatore UV utilizzato. È possibile testare un intervallo di dose compreso tra 0,010-0,015 J/cm^2.
2. Recupero del verme dopo irradiazione:
   1. Posizionare le piastre con vermi irradiati durante la notte a 15 °C per il recupero.
   2. Controlla il numero di animali vivi. Nelle nostre mani, un tasso di sopravvivenza di circa l'80-90% è adattato per un'irradiazione efficiente.
   3. Far crescere gli animali irradiati a 15-25 °C fino a quando la progenie non ha raggiunto lo stadio di sviluppo consentendo l'osservazione dell'espressione del marcatore di coiniezione.

2. Isolamento delle linee transgeniche integrate

1. Selezione di animali F1:
   1. Singolo 150-200 animali fluorescenti F1 su piastre di coltura separate. Per linee altamente trasmittenti (≥80%), sono sufficienti 100 animali F1.
   2. Mantenere queste piastre F1 a 15-25 °C fino a quando la progenie raggiunge uno stadio appropriato per l'osservazione di animali F2 fluorescenti.
   3. Scartare tutte le lastre F1 che presentano i) nessuna progenie, indicando che l'animale F1 era sterile o morto, o ii) nessuno o solo pochi animali F2 fluorescenti, indicando che l'animale F1 non ha trasmesso il transgene alla velocità prevista. Questo passaggio è rapido e rappresenta un vero vantaggio rispetto al protocollo standard che richiede una stima della percentuale di worm F2 fluorescenti per selezionare lastre F1 che presentano una progenie fluorescente ≥75% (Tabella 1).
2. Selezione di animali F2:
   1. Singolo quattro animali F2 transgenici fluorescenti da ogni piastra F1 selezionata. Quando si utilizzano transgeni fluorescenti (ad esempio mCherry, gfp o dsRed), raccogliere vermi F2 con un alto livello di fluorescenza in quanto ciò potrebbe indicare che questi animali sono omozigoti per l'array integrato. Si noti che quando si raccolgono animali F2 è fondamentale non portare con sé uova o larve, al fine di evitare falsi negativi nel passaggio successivo.
   2. Coltiva animali F2 a 15-25 °C.
3. Isolamento e convalida di ceppi transgenici integrati:
   1. Piastre Screen F2 per vermi F3 transgenici fluorescenti al 100%. Lo schermo è abbastanza rapido in quanto la presenza di un singolo verme non fluorescente indica che la piastra deve essere gettata via. Un omozigoto animale F2 per il transgene integrato darà una progenie fluorescente omozigote al 100%.
   2. Singolo otto animali F3 fluorescenti da piastre selezionate per confermare l'eredità al 100% del transgene. In teoria, la raccolta di un animale è sufficiente in questo passaggio. Tuttavia, la raccolta di otto animali F3 fluorescenti può essere necessaria per evitare di selezionare animali non fertili o malsani poiché l'irradiazione può indurre casualmente mutazioni che influenzano geni importanti per la fisiologia dei vermi.
   3. Se possibile, mantenere diversi ceppi transgenici integrati indipendenti, vale a dire ceppi recuperati da diversi animali F1.

Representative Results

La tabella 1. Confronto dei protocolli standard e migliorati per l'integrazione degli array extracromosomiali nelgenoma di C. elegans. Due transgeni non integrati che trasmettono all'infrequenza più o meno alla stessa frequenza sono stati integrati utilizzando lo standard o il protocollo migliorato. La differenza principale sta nel fatto che nel protocollo standard viene eseguito uno schermo della progenie su tutte le piastre F1 per stimare la percentuale di vermi F2 transgenici, che dovrebbero essere ≥ 75%. Questo passaggio richiede molto tempo, in particolare se la velocità di trasmissione iniziale è vicina al 75%. Nel protocollo migliorato, è sufficiente singolo quattro vermi F2 da ogni piastra F1 che trasporta animali F2 transgenici e per migliorare il 100% dei vermi transgenici nella progenie (F3), che possono essere eseguiti rapidamente. Il protocollo standard è adattato.  

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
U.V. cross-linker	Fischer Scientific		Wavelength 254 nm
Microscope SteREO Discovery V8	Carl Zeiss, Inc.
Petri dishes, 60 mm	CML	BPS55E6
Platinium wire 0.25 mm	Alfa Aesar	6/4/7440	To make a pick for worms