UV照射:染色体外配列を統合する方法

Overview

トランス遺伝子のマイクロインジェクションは通常 、C.エレガンス 株に大きな染色体外配列をもたらし、その結果、トランスジーンの可変発現および伝達が生じる。 UV照射は、配列の染色体集積およびより安定したトランスジーン透過を誘導することができる。

Protocol

このプロトコルは、C.エレガンスゲノム、J.Vis.Exp.(2013)に高伝達率を有する染色体外配列を統合するための迅速なプロトコルであるMariolらからの抜粋である。 

1. 紫外線照射とトランスジェニックワームの回収

1. ワーム照射:
   1. 30~100個の蛍光トランスジェニックL4動物を別々の培養プレート(15〜20匹の動物)に別々の培養プレートに選びます。
   2. 蓋を取り外したプレートをUVクロスリンカーに入れます。0.012 J/cm²でワームを照射します。株は多かれ少なかれUVに敏感であり、その結果は、使用されるUV照射器に応じて可変することができることに注意してください。0.010-0.015 J/cm²の間の線量範囲をテストすることができます。
2. 照射後のワーム回復:
   1. 照射されたワームを含むプレートを15°Cで一晩置き、回収します。
   2. 生きている動物の数を確認してください。私たちの手では、約80〜90%の生存率が効率的な照射のために適応されています。
   3. 15-25°Cで照射された動物を、発生段階に達するまで、共噴射マーカー発現の観察を可能にする。

2. 統合トランスジェニックラインの絶縁

1. F1動物の選択:
   1. 単一の150〜200の蛍光F1動物を別々の培養プレートに。高透過ライン(≥80%)の場合、100匹のF1動物で十分です。
   2. これらのF1プレートは、プロゲニーが蛍光F2動物の観察に適した段階に達するまで15〜25°Cに保ちます。
   3. i)を示すすべてのF1プレートを廃棄し、子孫、F1動物が無菌または死亡したことを示す、またはii)蛍光F2動物が少ないかまたはわずかであることを示し、F1動物が期待される速度でトランスジーンを伝達しなかったことを示す。このステップは迅速であり、蛍光F2ワームの割合を推定する必要がある標準プロトコルと比較した場合に、≥75%蛍光プロジニーを示すF1プレートを選択する(表1)。
2. F2動物の選択:
   1. 選択したF1プレートから4つの蛍光トランスジェニックF2動物が1匹。蛍光トランス遺伝子(例えばmCherry、gfp、dsRed)を使用する場合、これらの動物が統合アレイのホモ接合性であることを示す可能性があるため、蛍光レベルの高いF2ワームを選びます。F2動物を選ぶとき、次のステップで偽陰性を避けるために、卵や幼虫に沿って運ばないようにすることが重要であることに注意してください。
   2. 15-25 °CでF2動物を成長させる。
3. 統合トランスジェニック株の分離と検証:
   1. 100%蛍光トランスジェニックF3ワーム用のF2プレートをスクリーニングします。単一の非蛍光ワームの存在は、プレートが捨てられるべきであることを示しているので、画面は非常に迅速です。統合されたトランスジーンのためのF2動物ホモ接合は、100%ホモ接合蛍光プロジニーを与える。
   2. 選択したプレートから8つの蛍光F3動物を単一に、トランスジーンの100%相続を確認した。理論的には、このステップでは1匹の動物を選ぶだけでは十分です。しかし、8匹の蛍光F3動物を選ぶことは、放射線照射として未受の動物または不健康な動物を選択することを避けるために必要であり、ワーム生理学にとって重要な遺伝子に影響を与える突然変異を無作為に誘発する可能性がある。
   3. 可能であれば、いくつかの独立した統合トランスジェニック株、すなわち異なるF1動物から回収された株を保持する。

Representative Results

表 1.C.エレガンスゲノムへの染色体外配列の統合のための標準および改良されたプロトコルの比較。同じ周波数で伝達する2つの非統合されたトランス遺伝子は、標準または改良されたプロトコルを使用して統合された。主な違いは、標準プロトコルでは、すべてのF1プレート上の子孫の画面がトランスジェニックF2ワームの割合を推定するために実行され、75%≥べきであるという事実にあります。このステップは、特に送信の初期率が75%に近い場合、長い時間がかかります。改良されたプロトコルでは、トランスジェニックF2動物を運ぶ各F1プレートから4つのF2ワームを単一にして、原生のトランスジェニックワームの100%をスクリーニングするだけで十分である(F3)、これは迅速に行うことができる。標準プロトコルが適合します。  

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
U.V. cross-linker	Fischer Scientific		Wavelength 254 nm
Microscope SteREO Discovery V8	Carl Zeiss, Inc.
Petri dishes, 60 mm	CML	BPS55E6
Platinium wire 0.25 mm	Alfa Aesar	6/4/7440	To make a pick for worms